本發(fā)明涉及l(fā)gr5結(jié)合劑，特別是與lgr5結(jié)合的抗體或其片段和衍生物，以及此類結(jié)合劑在治療例如癌癥和炎癥性疾病的疾病，以及檢測lgr5中的用途。

背景技術(shù)：

1、wnt通路是一系列細胞間信號傳導(dǎo)通路之一，其協(xié)調(diào)后生動物的發(fā)育并調(diào)節(jié)成年組織中的干細胞功能。wnt通路的刺激是通過細胞外配體(通常是wnt)與細胞表面的同源wnt受體的結(jié)合和細胞內(nèi)的信號傳遞來啟動的。隨后的一系列分子相互作用最終導(dǎo)致了介導(dǎo)生物學(xué)輸出的環(huán)境特異性轉(zhuǎn)錄程序的活化。

2、wnt通路在維持成體干細胞自我更新和增殖中的主要作用已在廣泛的組織中功能性建立，所述組織包括沿胃腸道、肝臟、乳腺、皮膚的上皮干細胞區(qū)室和成熟b細胞區(qū)室。導(dǎo)致異常靶基因表達的wnt通路突變失調(diào)是這些組織和許多其他組織中癌癥發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素之一。wnt通路的致癌形式在結(jié)直腸癌(crc)中受到了相當大的關(guān)注，其中使通路活性失調(diào)的體細胞突變(最常見的是腫瘤抑制因子腺瘤性息肉病(apc)中的失活突變)是疾病病因中的早期的和普遍的病變。在其他上皮惡性腫瘤中，可能存在其他wnt通路調(diào)節(jié)組分中的一系列癌癥驅(qū)動突變；例如，在肝細胞癌的發(fā)展中，大約一半的病例獲得了β-聯(lián)蛋白的功能獲得性突變或axin1的失活突變。在一些上皮癌中，盡管wnt通路中缺乏突變，但異常通路活性和失調(diào)的靶基因表達是常見的特征，并且可能是其他細胞信號傳導(dǎo)通路的趨同調(diào)節(jié)的結(jié)果。

3、確定癌細胞特有的基因表達特征已使預(yù)后疾病標志物的鑒定成為可能，并為確定可用于治療的分子脆弱性提供了基礎(chǔ)。一項值得注意的研究在含有體細胞失活的apc的crc細胞系中鑒定了一組wnt靶基因。富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白受體5(lgr5)被鑒定為致癌wnt通路活性的基因靶標，隨后的工作將其確立為小鼠和人類的腸上皮、胃上皮、毛囊、胎兒乳腺、發(fā)育中的腎臟和再生肝臟中的腎單位的典型干細胞標志物。

4、lgr5是細胞表面gpcr樣受體家族的成員，所述受體家族包括lgr4和lgr6。雖然lgr4在整個身體的增殖細胞區(qū)室中廣泛表達，但lgr6對特定的干細胞區(qū)室(包括汗腺、濾泡間表皮和指甲干細胞)表現(xiàn)出更有限的表達。所述三個lgr家族蛋白是r-spondin家族蛋白的共同受體，rnf43或znrf3是其他的共同受體。rnf43和znrf3是下調(diào)細胞表面相關(guān)的wnt受體的泛素連接酶。通過募集到lgr結(jié)合的r-spondin，從wnt受體中阻斷rnf43/znrf3，可以增加細胞表面的wnt通路受體的穩(wěn)態(tài)水平以及通路活性對wnt配體刺激的反應(yīng)性。

5、lgr5因其在具有導(dǎo)致通路活性失調(diào)的致癌突變的癌癥中過表達，而引起了極大的治療興趣。大量研究表明，相對于鄰近的正常腸組織，lgr5在crc腫瘤和腸腺癌中的表達增加，并表明lgr5與腫瘤侵襲前沿的細胞和轉(zhuǎn)移細胞有關(guān)。作為crc的預(yù)后標志物，患者樣本中的lgr5轉(zhuǎn)錄本水平與較短的總生存期和減少的無病生存期有關(guān)。

6、在功能上，crc細胞系中l(wèi)gr5充分性研究在增殖能力、遷移、化學(xué)敏感性、集落形成和體內(nèi)移植能力方面具有先天作用。使用人類crc類器官異種移植物的研究發(fā)現(xiàn)，表達lgr5的細胞區(qū)室比不表達lgr5的細胞區(qū)室更具增殖性。

7、許多其他惡性腫瘤的特征是lgr5過表達增加：基底細胞癌、膠質(zhì)母細胞瘤(其中上調(diào)的lgr5與癌癥干細胞標志物cd133共定位預(yù)示著不良預(yù)后)、卵巢腫瘤、er陰性乳腺癌(其中在癌癥發(fā)展過程中高lgr5表達與更差的預(yù)后相關(guān))和b細胞惡性腫瘤。

8、綜上所述，雖然lgr5在癌癥發(fā)展中可能具有積極的、相反的或功能冗余的作用，但細胞表面的lgr5過表達是各種癌癥類型的特征，為區(qū)分癌細胞和非惡性組織提供了分子手段。

9、免疫療法是一類有前途的療法，其中一些療法利用抗體結(jié)合的特異性和有效性來識別癌細胞上過表達的細胞表面蛋白。事實上，抗體是當今最暢銷的一類藥物之一；十大最暢銷藥物中有五種是抗體?？贵w的多功能性和特異性已被廣泛用于檢測和特異性殺死多種癌癥類型的癌細胞。治療性抗體包括諸如抗體依賴性細胞毒性(adcc)、抗體-藥物綴合物(adc)、嵌合抗原受體(car)和雙特異性免疫細胞銜接子(例如雙特異性t細胞銜接子，bite)等形式。

10、盡管針對lgr5的抗體具有臨床潛力，但只有少數(shù)(如果有的話)經(jīng)過了強有力的驗證，這阻礙了確定正常組織和疾病中相對lgr5蛋白水平、研究細胞生物學(xué)或開發(fā)針對特定癌癥類型的免疫療法的努力。

11、本發(fā)明的目的是解決用于疾病的治療，特別是癌癥和炎癥性疾病的治療的基于抗體的治療的需求。本發(fā)明的目的還在于提供針對lgr5的抗體，用作研究工具以及用于疾病的治療和診斷。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及l(fā)gr5結(jié)合劑。特別地，本發(fā)明涉及與人和食蟹猴(cyno)lgr5結(jié)合的抗體，其中所述抗體結(jié)合lgr5(seq?id?no.1)的氨基酸22-37內(nèi)的表位，以及用于治療疾病(例如癌癥和/或炎癥性疾病)和鑒定生物樣品中l(wèi)gr5存在的相關(guān)方法。本發(fā)明在一定程度上基于發(fā)明人的研究，他們在研究中發(fā)現(xiàn)，針對lgr5的氨基酸22-37內(nèi)的特定表位的抗體是高度特異性的，具有高親和力，并被表達lgr5的癌細胞快速攝取。發(fā)明人已經(jīng)說明，本發(fā)明的抗體能夠區(qū)分具有高水平lgr5表達的細胞和具有較低lgr5表達水平的細胞。本發(fā)明的抗體因此代表了優(yōu)秀的研究工具，并且在治療(例如治療癌癥，特別是表達lgr5的癌癥)中特別有用。

2、在一個方面，本發(fā)明涉及與人lgr5結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體結(jié)合位于seq?id?no.1的氨基酸22-37內(nèi)的表位。

3、在一個方面，本發(fā)明涉及結(jié)合表位的抗體或其片段，所述表位包含或由seq?idno.1的氨基酸22-37組成。

4、在一個實施方案中，抗體是人的或人源化的。在一個實施方案中，抗體是鼠抗體。

5、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體的vh包含以下cdr1、cdr2和cdr3：

6、a)seq?id?no.2或與seq?id?no.2具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.3或與seq?id?no.3具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.4或與seq?id?no.4具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

7、b)seq?id?no.8或與seq?id?no.8具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.9或與seq?id?no.9具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.10或與seq?idno.10具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

8、c)seq?id?no.14或與seq?id?no.14具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.15或與seq?id?no.15具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.16或與seq?idno.16具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

9、d)seq?id?no.20或與seq?id?no.20具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.21或與seq?id?no.21具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.22或與seq?idno.22具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

10、e)seq?id?no.26或與seq?id?no.26具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.27或與seq?id?no.27具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.28或與seq?idno.28具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

11、f)seq?id?no.32或與seq?id?no.32具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.33或與seq?id?no.33具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.34或與seq?idno.34具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

12、g)seq?id?no.38或與seq?id?no.38具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.39或與seq?id?no.39具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.40或與seq?idno.40具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

13、h)seq?id?no.44或與seq?id?no.44具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.45或與seq?id?no.45具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.46或與seq?idno.46具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

14、i)seq?id?no.50或與seq?id?no.50具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.51或與seq?id?no.51具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.52或與seq?idno.52具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

15、j)seq?id?no.56或與seq?id?no.56具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.57或與seq?id?no.57具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.58或與seq?idno.58具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

16、k)seq?id?no.62或與seq?id?no.62具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.63或與seq?id?no.63具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.64或與seq?idno.64具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

17、l)seq?id?no.68或與seq?id?no.68具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.69或與seq?id?no.69具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.70或與seq?idno.70具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

18、m)seq?id?no.74或與seq?id?no.74具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.75或與seq?id?no.75具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.76或與seq?idno.76具有至少90％同源性的序列的cdr3。

19、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體的vl包含以下cdr1、cdr2和cdr3：

20、a)seq?id?no.5或與seq?id?no.5具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.6或與seq?id?no.6具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.7或與seq?id?no.7具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

21、b)seq?id?no.11或與seq?id?no.11具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.12或與seq?id?no.12具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.13或與seq?idno.13具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

22、c)seq?id?no.17或與seq?id?no.17具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.18或與seq?id?no.18具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.19或與seq?idno.19具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

23、d)seq?id?no.23或與seq?id?no.23具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.24或與seq?id?no.24具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.25或與seq?idno.25具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

24、e)seq?id?no.29或與seq?id?no.29具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.30或與seq?id?no.30具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.31或與seq?idno.31具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

25、f)seq?id?no.35或與seq?id?no.35具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.36或與seq?id?no.36具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.37或與seq?idno.37具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

26、g)seq?id?no.41或與seq?id?no.41具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.42或與seq?id?no.42具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.43或與seq?idno.43具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

27、h)seq?id?no.47或與seq?id?no.47具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.48或與seq?id?no.48具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.49或與seq?idno.49具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

28、i)seq?id?no.53或與seq?id?no.53具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.54或與seq?id?no.54具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.55或與seq?idno.55具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

29、j)seq?id?no.59或與seq?id?no.59具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.60或與seq?id?no.60具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.61或與seq?idno.61具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

30、k)seq?id?no.65或與seq?id?no.65具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.66或與seq?id?no.66具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.67或與seq?idno.67具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

31、l)seq?id?no.71或與seq?id?no.71具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.72或與seq?id?no.72具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.73或與seq?idno.73具有至少90％同源性的序列的cdr3；或

32、m)seq?id?no.77或與seq?id?no.77具有至少90％同源性的序列的cdr1，seq?idno.78或與seq?id?no.78具有至少90％同源性的序列的cdr2，seq?id?no.79或與seq?idno.79具有至少90％同源性的序列的cdr3。

33、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體包含選自seq?idno:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104的vh序列。

34、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體包含選自seq?idno:81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105的vl序列。

35、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體包含：

36、(a)seq?id?no:80的vh序列和seq?id?no:81的vl序列；

37、(b)seq?id?no:82的vh序列和seq?id?no:83的vl序列；

38、(c)seq?id?no:84的vh序列和seq?id?no:85的vl序列；

39、(d)seq?id?no:86的vh序列和seq?id?no:87的vl序列；

40、(e)seq?id?no:88的vh序列和seq?id?no:89的vl序列；

41、(f)seq?id?no:90的vh序列和seq?id?no:91的vl序列；

42、(g)seq?id?no:92的vh序列和seq?id?no:93的vl序列；

43、(h)seq?id?no:94的vh序列和seq?id?no:95的vl序列；

44、(i)seq?id?no:96的vh序列和seq?id?no:97的vl序列；

45、(j)seq?id?no:98的vh序列和seq?id?no:99的vl序列；

46、(k)seq?id?no:100的vh序列和seq?id?no:101的vl序列；

47、(l)seq?id?no:102的vh序列和seq?id?no:103的vl序列；或

48、(m)seq?id?no:104的vh序列和seq?id?no:105的vl序列。

49、在一個方面，本發(fā)明涉及與lgr5結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體包含如表3所示克隆的vh、ch、vl和cl?seq?id?no：106-156的組合或與其具有至少70％、80％或90％同源性的序列或如表3所示抗體克隆的序列或與其具有至少70％、80％或90％同源性的序列。

50、在一個實施方案中，所述抗體或其片段與人lgr5結(jié)合。所述抗體或片段也可以與食蟹猴(cyno)lgr5中的相應(yīng)序列(氨基酸22-37)結(jié)合。

51、在實施方案中，所述抗體或其片段是單克隆抗體。

52、在實施方案中，所述抗體或其片段是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

53、在實施方案中，所述抗體或其片段能夠以小于約4nm的kd結(jié)合lgr5。

54、在實施方案中，所述片段包含fab、scfv或單域抗體。

55、在實施方案中，所述抗體或其片段與毒素、酶、放射性同位素、標記物、治療分子或其他化學(xué)部分綴合。

56、在另一方面，本發(fā)明涉及免疫綴合物，其包含與治療劑連接的根據(jù)本發(fā)明抗體或其片段。

57、所述治療劑可以是毒素、酶、放射性同位素或其他化學(xué)部分。

58、在另一方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的抗體或其片段或如本文所述的免疫綴合物和藥物載體的藥物組合物。

59、在另一方面，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，其包括施用治療有效量的如本文所述的抗體或其片段、如本文所述的免疫綴合物或如本文所述的藥物組合物。

60、在另一方面，本發(fā)明涉及如本文所述的抗體或其片段、如本文所述的免疫綴合物或如本文所述的藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。

61、在另一方面，本發(fā)明涉及用作藥物的如本文所述的抗體或其片段、如本文所述的免疫綴合物或如本文所述的藥物組合物。

62、在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療癌癥的的如本文所述的抗體或其片段、如本文所述的免疫綴合物或如本文所述的藥物組合物。

63、在實施方案中，所述癌癥是lgr5陽性癌癥。

64、在實施方案中，所述癌癥過表達lgr5。

65、在實施方案中，癌癥選自頭部或頸部癌癥、子宮癌、結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、白血病(例如急性淋巴細胞白血病(all))、肝癌(例如肝細胞癌)或胰腺癌。

66、在另一方面中，本發(fā)明涉及包含編碼如本文所述的抗體或其片段的核苷酸序列的分離的核酸分子。

67、在另一方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的核酸的載體。

68、在另一方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的核酸或如本文所述的載體的宿主細胞。

69、所述宿主細胞可以是細菌、病毒或哺乳動物細胞。

70、在又一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生如本文所述抗體的方法，所述方法包括在適合表達編碼抗體的多核苷酸的條件下培養(yǎng)如本文所述的宿主細胞并分離抗體。

71、在另一方面，本發(fā)明涉及檢測生物樣品中l(wèi)gr5的方法，所述方法包括在允許抗體與lgr5結(jié)合的條件下，將生物樣品與如本文所述的抗體接觸，并檢測抗體與lgr5之間是否形成復(fù)合物。

72、在實施方案中，生物樣品可以是選自頭部或頸部癌癥、子宮癌、結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、白血病(例如急性淋巴細胞白血病(all))、肝癌(例如肝細胞癌)或胰腺癌的癌癥樣品。

73、在另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒包含如本文所述的抗體，如本文所述的免疫綴合物，任選地具有使用說明，或如本文所述的藥物組合物。

74、在另一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合劑，例如與本文所述抗體基本相同的表位結(jié)合的抗體或其片段或與本文提供的抗體之一競爭結(jié)合人lgr5或食蟹猴lgr5的抗體或其片段。

75、在另一方面，本發(fā)明涉及包含表位的分離的合成或重組肽，所述肽由seq?id?no:1的殘基22至37組成。

76、在另一方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的抗體或其片段的嵌合抗原受體(car)。

77、在另一方面，本發(fā)明涉及包含seq?id?no.211或與seq?id?no.211具有至少70％、80％或90％同源性的序列的car。在一個實施方案中，car包含克隆2.4的cdr。

78、在另一方面，本發(fā)明涉及表達這種car的細胞或細胞群。

79、在另一方面，本發(fā)明涉及用于適應(yīng)性免疫療法的這種細胞或細胞群。

80、在另一方面，本發(fā)明涉及包括施用這種細胞或細胞群的適應(yīng)性免疫療法的方法。

81、在另一方面，本發(fā)明涉及免疫細胞銜接子，例如雙特異性t細胞銜接子，即bite或三特異性殺傷銜接子trike，所述免疫細胞銜接子包含如本文所述的抗體或片段。在一個實施方案中，bite或trike包含克隆2.4的cdr。

82、在另一方面，本發(fā)明涉及包含seq?id?no.211或與seq?id?no.211具有至少70％、80％或90％同源性的序列的bite。

83、在另一方面，本發(fā)明涉及包含表位的分離的合成或重組肽，所述肽由seq?id?no:1的殘基22至37組成。

84、在另一方面，本發(fā)明涉及診斷或評估癌癥進展的方法，其包括評估lgr5的表達和/或評估lgr5的蛋白水平。