本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、納米材料因其具有耐高溫、延展性好、比表面積、抗應(yīng)變能力好、電阻率低等獨(dú)特性而受到廣泛關(guān)注，當(dāng)納米材料尺寸達(dá)到一定范圍時(shí)，它們的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)將會(huì)改變，納米銀具有優(yōu)異的導(dǎo)電性能和催化性能，且成本低，它憑借著納米尺寸效應(yīng)，其體積小，比表面積大，在表面活性，催化性能和抑菌性能都有較大的提升，在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景：如作為催化劑，抗菌材料，醫(yī)藥材料，電子漿料等納米銀是指銀元素的納米級(jí)顆粒，也就是其粒子尺寸在納米尺度范圍內(nèi)，通常在1到100納米之間。銀納米顆粒由于其獨(dú)特的電學(xué)、光學(xué)和生物學(xué)特性，近年來被電子元器件、納米器件制造、催化、生物傳感、藥物遞送等領(lǐng)域青睞。納米銀制備的導(dǎo)電墨水通過噴墨打印形成納米銀線，以高透明度、導(dǎo)電性、機(jī)械柔韌性廣泛應(yīng)用于柔性電子材料領(lǐng)域中；同時(shí)納米顆粒獨(dú)特的等離子體共振體性質(zhì)使其可以進(jìn)行生物標(biāo)記和傳感成像用于醫(yī)學(xué)診斷。納米銀顆?？梢砸种瓢┘?xì)胞增殖，是一種潛在的抗腫瘤制劑。銀納米粒子的抗微生物特性同樣備受關(guān)注，可以通過漿內(nèi)添加或者表面涂布的方式制備成導(dǎo)電紙、抗菌紙、電磁屏蔽紙、生物檢測紙等功能紙。

2、納米銀的抗菌作用是通過結(jié)合和穿透細(xì)菌細(xì)胞壁而發(fā)生的。一旦進(jìn)入細(xì)胞，納米銀就會(huì)帶來結(jié)構(gòu)變化，擾亂dna、細(xì)胞酶和呼吸系統(tǒng)的生化過程，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。然而，納米銀釋放的銀離子和納米銀產(chǎn)生的活性氧(ros)，它們負(fù)責(zé)細(xì)菌的生長抑制。由于納米銀的物理和化學(xué)性質(zhì)取決于其尺寸、形狀和表面電荷；因此，它們可以直接影響它們的抗菌活性。納米銀對(duì)大腸桿菌的形狀依賴性抗菌相互作用，其中發(fā)現(xiàn)具有晶格平面的截頭球形銀納米板具有最強(qiáng)的殺生物作用，并與球形銀納米粒子進(jìn)行了比較。球形納米銀的尖銳邊緣、頂點(diǎn)和高原子密度面被認(rèn)為具有更高的抗菌作用。

3、納米銀可以通過物理、化學(xué)、生物等多種方法合成。物理法原理簡單，制備的納米銀顆粒純度和活度都較高，但顆粒不穩(wěn)定，能耗大，且對(duì)設(shè)備要求很高。化學(xué)還原法對(duì)設(shè)備的要求較為簡單，且合成的納米銀粒徑較窄，分布均勻。但化學(xué)還原法通常會(huì)使用一些有機(jī)溶劑，這些有機(jī)溶劑毒性強(qiáng)，污染嚴(yán)重。因此，生物還原法制備納米銀應(yīng)運(yùn)而生。該法具有操作簡單、成本低和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，生物合成法通常需要較少的化學(xué)品使用，具有反應(yīng)溫和，生產(chǎn)成本低，綠色環(huán)保無污染，而且在反應(yīng)過程當(dāng)中不需要還原劑等添加劑就可以完成納米銀制備的等一系列優(yōu)點(diǎn)，隨著綠色觀念、環(huán)保觀念的普及，利用生物系統(tǒng)合成納米銀粒子的生物法備受關(guān)注，在生物法合成納米銀中，圍繞微生物和植物提取物合成納米銀研究很多，關(guān)于生物大分子蛋白合成納米銀研究較少，如何獲得更多可以合成納米銀的蛋白非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：納米銀形貌決定了納米銀性能，現(xiàn)有物理法、化學(xué)法、生物法合成納米銀大多是通過改變合成條件和工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)形貌控制，針對(duì)納米銀合成蛋白研究較少和利用大分子蛋白實(shí)現(xiàn)納米銀形貌可控合成問題，本發(fā)明將非納米銀合成蛋白改造成納米銀合成蛋白，本發(fā)明提供一種基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15及其編碼基因和應(yīng)用，本發(fā)明基于大規(guī)模突變獲得的蛋白yna15可以更加高效合成納米銀以及提高納米銀的抑菌性能。本發(fā)明通過全基因合成dna序列，構(gòu)建了編碼納米銀合成蛋白yna15的基因，本發(fā)明構(gòu)建的全新的納米銀合成蛋白和基因，可以作為新的模版，進(jìn)一步得可以根據(jù)設(shè)計(jì)要求，精確地調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，提高了納米銀合成效率。

2、本發(fā)明還提供所述載體、工程菌及其應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15的編碼基因，所述蛋白yna15編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明所述基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15，所述蛋白yna15的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、其中，所述蛋白yna15以蛋白8p4y為模版，通過大規(guī)模突變氨基酸獲得如seq?idno.2所示蛋白yna15的編碼基因進(jìn)行全基因合成。

6、進(jìn)一步地，為了高效合成納米銀，以已知蛋白的氨基酸序列(seq?id?no.3)為模版，通過對(duì)氨基酸編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬和表面電荷預(yù)測，分析各結(jié)構(gòu)域的功能和作用，通過模擬電荷分析，大量篩選蛋白8p4y的突變位點(diǎn)，然后進(jìn)一步的篩選位于表面的氨基酸，對(duì)該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行大規(guī)模突變，得到的蛋白yna15氨基酸序列，進(jìn)行全基因合成，獲得序列如seq?id?no.1所示編碼高效合成納米銀蛋白的基因，構(gòu)建重組載體，將重組載體導(dǎo)入原核表達(dá)宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)純化。

7、本發(fā)明所述重組載體，所述重組載體包括所述的編碼基因。

8、其中，所述重組載體以pet-28a為質(zhì)粒載體攜帶權(quán)利要求1所述的編碼基因。

9、本發(fā)明所述工程菌，其特征在于，所述工程菌包括所述的基于全基因合成納米銀蛋白yna15的編碼基因或者所述的基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15或者所述的重組載體。

10、本發(fā)明所述的基于全基因合成納米銀蛋白yna15的編碼基因或者所述的基于全基因合成高效制備納米銀的蛋白yna15或者所述的重組載體或者所述的工程菌在制備納米銀中的應(yīng)用。

11、其中，通過生物法在制備納米銀中的應(yīng)用。

12、其中，所述應(yīng)用中以硝酸銀為底物濃度10～30mm，溫度為30～70℃，轉(zhuǎn)速120～220rpm,ph為9～13，反應(yīng)時(shí)間16～24h。

13、其中，所述應(yīng)用中制備的納米銀為球形納米銀，粒徑大小分布于2～25nm。經(jīng)過掃描電鏡sem的表征發(fā)現(xiàn)粒徑小于10nm的納米銀呈現(xiàn)團(tuán)聚狀態(tài)，大多是單顆粒的粒徑不超過20nm。4-5個(gè)小粒徑agnps粒子團(tuán)聚成50nm左右的納米團(tuán)簇，而單顆粒超過20nm的粒子表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。分散性較好。其原因在于，納米顆粒的粒徑下降，其表面原子比例增加，導(dǎo)致表面配位數(shù)不足和高表面能，從而納米銀處于高度活化狀態(tài)，從而粒徑小的納米銀會(huì)呈現(xiàn)出團(tuán)聚狀態(tài)。

14、本發(fā)明通過大規(guī)模突變氨基酸，首先分析8p4y合成納米銀的關(guān)鍵序列，對(duì)其序列進(jìn)行大規(guī)模突變，進(jìn)行全基因合成，能夠合成具有生物活性的納米銀。本發(fā)明所述基因編碼的能夠高效合成具有生物活性納米銀的蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。本發(fā)明將目的基因與載體進(jìn)行連接得到重組載體，將重組載體導(dǎo)入原核表達(dá)宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)純化，本發(fā)明所述yna15蛋白突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

15、本發(fā)明運(yùn)用蛋白質(zhì)工程的技術(shù)人工改造后的蛋白在一定的條件下可以將底物硝酸銀還原成納米銀，以更好地揭示納米銀合成機(jī)理，同時(shí)以釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，蠟黃芽胞桿菌探究該生物法合成納米銀的抑菌能力。本發(fā)明每次納米銀合成條件穩(wěn)定，合成的納米銀粒徑可控，該生物法合成的納米銀具有良好的生物活性。

16、本發(fā)明通過在pdb蛋白數(shù)據(jù)庫篩選到蛋白8p4y，其是一個(gè)合成結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可以在大腸桿菌中表達(dá)，但是其不具備合成納米銀的能力，本發(fā)明以其氨基酸作為模板進(jìn)行突變獲得了基于全基因合成高效合成納米銀的蛋白yna15。

17、本發(fā)明利用生物合成學(xué)原理，通過合成dna序列，構(gòu)建了編碼納米銀合成蛋白yna15的基因，這使得可以根據(jù)設(shè)計(jì)要求，精確地調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明的yna15編碼的蛋白質(zhì)具有特定的生物還原性質(zhì)，能夠?qū)y離子還原為納米銀顆粒，這種蛋白質(zhì)在合成納米銀過程中起到了催化作用，促進(jìn)了納米銀的形成。

18、本發(fā)明通過大規(guī)模突變合成的蛋白yna15，可以通過生物合成的方法，更高效地合成納米銀，相比傳統(tǒng)的合成方法可能更節(jié)省時(shí)間和成本，通過調(diào)控基因序列，可以精確地控制蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而控制納米銀的性質(zhì)，使其適用于不同的應(yīng)用場景，生物合成的方法通常更加環(huán)保和生物友好，與化學(xué)合成相比，減少了對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人體健康的危害?？梢愿鶕?jù)需要設(shè)計(jì)不同的蛋白質(zhì)，以滿足特定應(yīng)用的需求，從而提高了納米銀的定制化程度。

19、本發(fā)明利用了全基因合成技術(shù)，通過合成dna序列，實(shí)現(xiàn)了對(duì)編碼納米銀合成蛋白yna15的基因的精確設(shè)計(jì)和控制。相比傳統(tǒng)的基因克隆和突變方法，全基因合成技術(shù)具有更高的自由度和靈活性，可以更精確地調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。yna15編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)過了精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，具有更高的催化活性和穩(wěn)定性，能夠更有效地將銀離子還原為納米銀顆粒。

20、本發(fā)明優(yōu)化設(shè)計(jì)使得納米銀的合成過程更加高效和可控。實(shí)現(xiàn)了納米銀的高效合成和可控性，相比傳統(tǒng)方法更節(jié)省時(shí)間和成本，并且能夠精確地調(diào)控納米銀的性質(zhì)。生物合成的方法通常更加環(huán)保和生物友好，減少了對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人體健康的危害，與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法相比具有更高的安全性和可持續(xù)性。

21、本發(fā)明構(gòu)建的全新的納米銀合成基因和蛋白，可以作為新的模版，提供更多的突變位點(diǎn)，為后續(xù)開發(fā)更加優(yōu)異的納米銀合成蛋白提供材料。

22、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

23、1、本發(fā)明經(jīng)過蛋白質(zhì)工程，人工改造得到全新的蛋白序列，通過全基因合成能夠穩(wěn)定合成納米銀的蛋白，條件可控，粒徑可控，合成成本低，對(duì)環(huán)境綠色無污染。

24、2、本發(fā)明的基于全基因合成得到的yna15蛋白，在溫度范圍30℃～70℃，ph范圍在9～13，合成時(shí)間16～24h的條件下，對(duì)納米銀的合成效率較高，得到的生物納米銀溶液呈深褐色，性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑大多數(shù)分布在2～25nm，具有良好的生物活性和生物學(xué)功能。

25、3、本發(fā)明通過改造后的yna15蛋白合成的納米銀，粒徑可控，合成條件溫和，對(duì)釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，蠟黃芽胞桿菌均有良好的抑菌效果，具有及其廣闊的應(yīng)用前景和工業(yè)價(jià)值。

26、4、本發(fā)明經(jīng)過人工改造的蛋白成功合成了納米銀，發(fā)現(xiàn)該改造蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域，對(duì)其關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行大規(guī)模突變，經(jīng)過重組載體和原核表達(dá)，得到可以大量制備具有高效合成生物納米銀能力的工程菌，該蛋白表達(dá)量高且蛋白質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明有利于揭示利用單一非酶催化蛋白制備納米銀的合成機(jī)制。