本發(fā)明涉及一種基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種xaa-pro氨基肽酶嵌合變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、氨基肽酶是一類從多肽鏈的n端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個(gè)游離出來的水解酶，其底物作用范圍較為廣譜，不僅能水解多肽，而且能水解完整的蛋白質(zhì)分子。氨基肽酶主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)水解、風(fēng)味肽和生物活性多肽制備，可應(yīng)用于食品、生物學(xué)與醫(yī)學(xué)、試劑等工業(yè)領(lǐng)域。

2、xaa-pro氨基肽酶(xaa-pro?dap；ec：3.4.14.11；又稱x-proryl二肽基氨基肽酶)是一類能從蛋白質(zhì)和多肽n端選擇性切除氨基酸殘基產(chǎn)生游離氨基酸的外切蛋白酶，尤其是裂解富含脯氨酸的β-酪蛋白。該酶主要來源于嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌亞種的培養(yǎng)提取物，乳品加工中用于加速奶酪熟化。

3、目前從微生物中純化xaa-pro氨基肽酶的工業(yè)化解決方案相對較少，工業(yè)化產(chǎn)品主要存在的問題表現(xiàn)為：酶的活性低、純化難度高、適用溫度范圍窄、45℃以上易失活等諸多缺點(diǎn)，使xaa-pro氨基肽酶的工業(yè)化應(yīng)用受到限制。

4、古菌域微生物最早被發(fā)現(xiàn)生活在溫泉、鹽湖之類的極端環(huán)境，也被稱之為嗜極微生物，此類微生物因能產(chǎn)生許多能承受高溫和有機(jī)溶劑的酶而著稱，包括鹽堿紅菌屬嗜鹵堿菌(natronorubrum?halalkaliphilum)。我們在石油中發(fā)現(xiàn)了類似鹽堿紅菌屬嗜鹵堿菌的dna片段，表明此菌能夠存活于石油形成過程中的極端環(huán)境中，并產(chǎn)生一些活性強(qiáng)且能夠抵御不利環(huán)境因素的酶類。發(fā)明人在鄭州大學(xué)石油及古生物基因庫中篩選到兩段來源于鹽堿紅菌屬嗜鹵堿菌、編碼xaa-pro氨基肽酶的dna序列；目前其宿主菌株還無法得到分離培養(yǎng)，我們利用這兩段dna系列構(gòu)建了一個(gè)全新的酶嵌合變體，并分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。如何利用遠(yuǎn)古生物基因庫中的dna序列，構(gòu)建全新編碼的氨基肽酶基因的相關(guān)研究尚未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種全新的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體及其應(yīng)用實(shí)例。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案：

3、一種xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的氨基酸序列如seq?id?no.8所示。

4、所述xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的編碼基因的dna序列如seq?id?no.7所示。

5、一種包含所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的載體。

6、一種包含所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的工程菌。

7、一種所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在胰高糖素樣肽-1ra生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。

8、一種所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在青儲飼料添加劑中的應(yīng)用。

9、一種所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在奶制品中的應(yīng)用。

10、一種所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的有益效果：

12、1.通過在鄭州大學(xué)石油及遠(yuǎn)古生物基因庫中篩選，找到兩段編碼xaa-pro氨基肽酶的dna序列，該序列與鹽堿紅菌屬嗜鹵堿菌氨基肽酶基因的dna序列高度相似。將這兩段序列拼接為一段較長的序列，再用拼接好的序列置換野生型序列的對應(yīng)部分，從而構(gòu)建一條全新編碼xaa-pro氨基肽酶的dna序列。

13、2.本發(fā)明中的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體和野生型相比，具有更好的酶活性、熱穩(wěn)定性，適用范圍更廣。

14、3.本發(fā)明的重組酶具有很好應(yīng)用價(jià)值，實(shí)驗(yàn)表明，利用xaa-pro氨基肽酶嵌合變體酶活性高的特點(diǎn)應(yīng)用于胰高糖素樣肽-1ra等藥物生產(chǎn)，能取得理想產(chǎn)率。此外，還可應(yīng)用在青儲飼料、豆奶、乳制品等生產(chǎn)中，添加xaa-pro氨基肽酶嵌合變體比氨基肽酶野生型或bactidenttm氨肽酶更具優(yōu)勢。

技術(shù)特征：

1.一種xaa-pro氨基肽酶嵌合變體，其特征在于，所述氨基肽酶的氨基酸序列如seq?idno.8所示。

2.如權(quán)利要求1所述xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的dna序列如seq?id?no.7所示。

3.一種包含權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的載體。

4.一種包含權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體的工程菌。

5.一種如權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在胰高糖素樣肽-1ra生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。

6.一種如權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在青儲飼料添加劑中的應(yīng)用。

7.一種如權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在奶制品中的應(yīng)用。

8.一種如權(quán)利要求1所述的xaa-pro氨基肽酶嵌合變體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種Xaa?Pro氨基肽酶嵌合變體及其應(yīng)用，該Xaa?Pro氨基肽酶嵌合變體蛋白是由石油及遠(yuǎn)古基因庫中篩選，來源于古菌域物種編碼氨基肽酶的DNA片段，通過置換Xaa?Pro氨基肽酶野生型對應(yīng)編碼序列而構(gòu)建成一種新型酶，與野生型相比，本發(fā)明的嵌合變體具有更高的酶活和熱穩(wěn)定性，適用范圍廣，可應(yīng)用于多肽藥物生產(chǎn)、飼料發(fā)酵、乳蛋白裂解以及豆奶生產(chǎn)等場景。

技術(shù)研發(fā)人員：趙萬千,關(guān)兵,張紅寧,張丹,劉鼎,周元尚,馮長訪,孫玉璽
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21