日韩成人黄色,透逼一级毛片,狠狠躁天天躁中文字幕,久久久久久亚洲精品不卡,在线看国产美女毛片2019,黄片www.www,一级黄色毛a视频直播

一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行HPV亞型的檢測方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:39561517發(fā)布日期:2024-09-30 13:35閱讀:60來源:國知局
一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行HPV亞型的檢測方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域,具體地,涉及一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv亞型的檢測方法和應(yīng)用。


背景技術(shù):

1、近年來,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈穩(wěn)定上升趨勢,國際癌癥研究中心預(yù)計(jì)到2030年新增病例數(shù)將增至93500例,到2050年將達(dá)到186600例。研究表明,高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染被確定為宮頸癌的原因之一,宮頸癌的發(fā)生中有80%與hpv的感染有關(guān)。宮頸癌致病因素明確,降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在很大程度上取決于宮頸癌的早期篩查;因此,提升宮頸癌的早篩技術(shù)并廣泛普及應(yīng)用對宮頸癌的預(yù)防或診療具有重要的臨床意義。

2、現(xiàn)有技術(shù)中,臨床上宮頸癌初篩的常規(guī)方法主要是hpv檢測和細(xì)胞學(xué)檢測。檢測hpv分型的常用技術(shù)為流式熒光雜交核酸分型檢測技術(shù),該技術(shù)雖然能檢查hpv分型,但是檢測步驟繁瑣,需要pcr擴(kuò)增后再進(jìn)行核酸雜交及熒光素標(biāo)記,最后在多功能流式點(diǎn)陣儀上讀取微球編碼及其對應(yīng)的熒光強(qiáng)弱信號,檢驗(yàn)結(jié)果回報(bào)時(shí)間偏長;而且pcr擴(kuò)增后開蓋檢測存在污染風(fēng)險(xiǎn),結(jié)果存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn);另一方面,細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)專家或是病理學(xué)家,然而,實(shí)踐中病理醫(yī)生極度短缺,技術(shù)水平和工作經(jīng)驗(yàn)參差不齊,尤其地,在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)細(xì)胞學(xué)檢查的推廣工作存在較大的難度。因此基于對宮頸癌早期細(xì)胞學(xué)篩查的需求,迫切需要找到一種不依賴于細(xì)胞病理學(xué)家、具有可接受的敏感性和特異性、可用于大規(guī)模人群篩查的細(xì)胞篩查方法。

3、熒光探針技術(shù)是近些年發(fā)展較快的一種新型檢測技術(shù),該方法因檢測高靈敏度、高特異性而備受接受,但是該方法因熒光素?cái)?shù)量影響,而無法實(shí)現(xiàn)超多重的檢測,并且應(yīng)用熒光探針技術(shù)開發(fā)的試劑為液相,因此試劑的運(yùn)輸溫度和保存環(huán)境要求在低溫下進(jìn)行,中國發(fā)明專利cn117535405a公開了一種結(jié)合凍干技術(shù)和熔解曲線的技術(shù)方案,該方案將熔解曲線和凍干技術(shù)相結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了一種超多重且能夠擺脫保存環(huán)境約束的方法;但是該方案應(yīng)用了不對稱擴(kuò)增技術(shù),因?yàn)橄拗屏似渲幸粭l引物,導(dǎo)致檢測靈敏度的損失。

4、因此,本發(fā)明提供一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv檢測方法和應(yīng)用,可以用于多種hpv分型的檢測,而且在解決存儲(chǔ)和運(yùn)輸上的問題的同時(shí),還能夠兼顧高檢測靈敏度的要求。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv檢測方法和應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)一種靈敏度高且方便運(yùn)輸和儲(chǔ)存,用于定性檢測hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型的一種方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案,一種熔解曲線分析結(jié)合凍干術(shù)進(jìn)行hpv基因檢測方法,其特征在于,采用凍干技術(shù)將引物和探針組合物、taq酶、凍干緩沖液進(jìn)行凍干后形成凍干微球;

3、以hpv樣本的核酸為模板dna,將所述凍干微球復(fù)融后,進(jìn)行pcr反應(yīng),完成所述pcr反應(yīng)后,進(jìn)行熒光采集,并根據(jù)繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行結(jié)果的判讀。

4、優(yōu)選地,所述hpv基因包括hpv52、hpv16、hpv58、hpv39、hpv18、hpv31、hpv33、hpv59型中的任一種。

5、優(yōu)選地,所述引物和探針組合物通過通過hpv基因序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)得到,包括八組引物和八條探針;

6、優(yōu)選地,所述八組引物,分別包括:

7、第一組引物包括5201f和5202r,序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示;

8、第一條探針包括5203,序列如seq?id?no.17所示;

9、第二組引物包括1601f和1602r,序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示;

10、第二條探針包括1603,序列如seq?id?no.18所示;

11、第三組引物包括5801f和5802r,序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示;

12、第三條探針包括5803,序列如seq?id?no.19所示;

13、第四組引物包括3901f和3902r,序列分別如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示;

14、第四條探針包括3903,序列如seq?id?no.20所示;

15、第五組引物包括1801f和1802r,序列分別如seq?id?no.9和seqidno.10所示;

16、第五條探針包括1803,序列如seq?id?no.21所示;

17、第六組引物包括3101f和3102r,序列分別如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示;

18、第六條探針包括3103,序列如seq?id?no.22所示;

19、第七組引物包括3301f和3302r,序列分別如seq?id?no.13和seq?id?no.14所示;

20、第七條探針包括3303,序列如seq?id?no.23所示;

21、第八組引物包括5901f和5902r,序列分別如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示;

22、第八條探針包括5903,序列如seq?id?no.24所示。

23、優(yōu)選地,taq酶和所述凍干緩沖液的體積比為1:1。

24、更優(yōu)選地,每1μl所述凍干緩沖液中包括5mm的mgcl2和4mm的海藻糖。

25、優(yōu)選地,所述凍干緩沖液中,包括24mm的(nh4)2so4、濃度為22mm的kcl、濃度為25mm的mgcl2、濃度為2.2mm的dntps、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%的tween-20、濃度為20mm的海藻糖、質(zhì)量濃度為8wt%的纖維二糖、質(zhì)量濃度為0.005wt%的bsa,tris-hcl調(diào)節(jié)ph至8n8.2,最后用te緩沖液補(bǔ)充至5μl。

26、優(yōu)選地,所述pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?5℃×5min,1cycle;95℃×5s,60℃×25s,45cycles;95℃×10s,1cycle;25-55℃升溫做熔解曲線,升溫速率為0.03℃/s;其中,60℃×25s和25-55℃升溫過程,采用fam、vic、rox熒光通道采集熒光。

27、優(yōu)選地,所述結(jié)果的判讀包括:

28、若fam熒光通道ct≤40時(shí),判斷為hpv-16型或hpv-18型陽性;

29、若vic熒光通道ct≤40時(shí),判斷為hpv-31型或hpv-33型或hpv-39型陽性;

30、若rox熒光通道ct≤40時(shí),判斷為hpv-52型或hpv-58型或hpv-59型陽性;

31、若fam、vic、rox熒光通道ct>40時(shí),判斷為hpv-52、16、58、39、18、31、33、59型陰性;

32、通過熔解曲線對應(yīng)的各熒光通道內(nèi)tm峰的判讀可以確定具體的hpv亞型,具體地,fam熒光通道中,若tm1=43±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-18型;

33、若tm2=51±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-16型;

34、vic熒光通道中,若tm1=37±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-31型;

35、若tm2=41±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-33型;

36、若tm3=48±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-39型;

37、rox熒光通道中,若tm1=32±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-59型;

38、若tm2=40±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-58型;

39、若tm3=48±1℃的峰消失時(shí),則判定為hpv-52型。

40、作為本發(fā)明另一個(gè)目的,還提供了一種用于hpv基因檢測的凍干微球,至少包括引物和探針組合物、taq酶和凍干緩沖液;其中,每單位凍干微球中的taq酶的含量為8u;所述凍干緩沖液為5μl。

41、作為本發(fā)明的目的之一,還提供了一種用于hpv檢測的試劑盒,至少包括上述的用于hpv基因檢測的凍干微球。

42、該發(fā)明的技術(shù)原理為:若樣本為上述hpv型別陽性,在pcr階段時(shí),相應(yīng)引物和探針會(huì)被消耗,因此在熔解曲線分析階段不能產(chǎn)生特定的熔解曲線峰;若樣本為上述hpv型別陰性,則pcr階段補(bǔ)損耗各引物探針;若樣本為上述hpv型別陽性,在pcr階段時(shí),相應(yīng)引物和探針會(huì)被消耗,因此在熔解曲線分析階段不能產(chǎn)生特定的熔解曲線峰;若樣本為上述hpv型別陰性,則pcr階段補(bǔ)損耗各引物探針,本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針在反應(yīng)過程中會(huì)自然卷曲,而在在熔解曲線過程中卷曲狀態(tài)解離,從而產(chǎn)生特定的熔解曲線峰。

43、本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比取得的有益效果:

44、1.采用本發(fā)明的技術(shù)方案,將引物探針組合物經(jīng)hplc級別純化后,與緩沖液、taq酶配置成可凍干反應(yīng)液,采用凍干工藝凍干后形成熔解曲線凍干微球;該熔解曲線凍干微球不僅容易保存,且使用簡單,只需加入待測核酸樣本后便可在熒光pcr儀上按預(yù)設(shè)的反應(yīng)程序運(yùn)行,避免了環(huán)境氣溶膠污染的問題。

45、2.采用本發(fā)明的技術(shù)方案,在探針的3’端引入若干個(gè)連續(xù)的鳥嘌呤g,通過淬滅熒光作用來降低反應(yīng)體系中的本底熒光,尤其地,能夠使得到的熔解曲線的峰值更窄,熔解曲線峰寬均為5-6℃,顯著地提高了檢測的準(zhǔn)確性。

46、3.采用本發(fā)明的技術(shù)方案能夠顯著地提高檢測的靈敏性,靈敏度提高至1000copies/ml。

當(dāng)前第1頁1 2 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1