水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特異性SNP分子 標(biāo)記引物及應(yīng)用，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記引物適于在水稻育種中對(duì)Piz-t基因型的大量篩 選以及從水稻種質(zhì)資源中篩選新的Piz-t基因型抗原。 技術(shù)背景
[0002] 水稻稻瘟病是危害全球水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的3大病害之一，每年都會(huì)對(duì)水稻生產(chǎn)造 成巨大的損失，通過(guò)選育抗性品種防治稻瘟病具有經(jīng)濟(jì)、有效與環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，能有效地減少 稻瘟病直接或間接帶來(lái)的損失。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，稻瘟病生理小種變異很快，含有單一抗 性基因的抗性品種長(zhǎng)期使用便會(huì)因?yàn)榈疚敛【碌膬?yōu)勢(shì)種群的出現(xiàn)而抗性漸失，因此，并 利用分子標(biāo)記輔助選擇組裝、聚合具有不同抗譜的抗性基因，培育廣譜、持久抗性水稻品種 成為解決問(wèn)題的最佳途徑。
[0003] Piz-t 位于水稻 6 號(hào)染色體短臂（Zhou B, Qu SH, Liu GF et al. The Eight Amino-Aci d Differences Within Three Leucine-Rich Repeats Between Pi2and Piz-t Resistance Protei ns Determine the Resistance Specificity to Magnaporthe grisea. MOL PLANT MICROBE I N, 2006, 19 (11) :1216-1228),是一個(gè)具有對(duì)稻瘟病生理小種 具有廣譜抗性的基因，因此對(duì)于培育具有廣譜抗性的水稻品種具有巨大的利用價(jià)值，但該 基因所在位點(diǎn)具有多個(gè)對(duì)不同稻瘟病生理小種具有抗性的等位基因包括Pi9、Pi-z、Pi-2 以及感病等位基因，因此對(duì)于該基因利用的前提是將它與其余等位基因區(qū)分開(kāi)。目前等位 性測(cè)定的方法是通過(guò)對(duì)含有不同等位基因的材料在溫室內(nèi)進(jìn)行不同稻瘟病生理小種接種 鑒定，根據(jù)它們的抗譜差異將不同等位基因區(qū)分開(kāi)來(lái)，但這種方法存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、復(fù)雜、 繁瑣，因此限制了它在育種中的應(yīng)用。
[0004] 分子標(biāo)記是一種快速、簡(jiǎn)便、成本低廉并可在水稻生長(zhǎng)早期進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)的一種 技術(shù)，但目前還沒(méi)有對(duì)Piz-t等位基因鑒定的分子標(biāo)記報(bào)導(dǎo)。本研宄通過(guò)對(duì)含有不同等位 基因材料目標(biāo)位點(diǎn)利用染色體步移（Chromosome walking)技術(shù)通過(guò)大量測(cè)序以及序列比 對(duì)鑒定到一個(gè)Piz-t基因型特異性SNP位點(diǎn)（Piz-t為A堿基，其余均為G堿基），在兩對(duì)交 叉引物 P CR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基礎(chǔ)上加以改 進(jìn)創(chuàng)新，通過(guò)在內(nèi)引物倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配堿基，開(kāi)發(fā)出鑒定該SNP位點(diǎn)不同堿基類型的 共顯性標(biāo)記，如圖1所示，通過(guò)設(shè)計(jì)4條引物（AF、AR、GF、GR)并利用待測(cè)品種基因組DNA進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶類型鑒定Piz-t基因型，如果擴(kuò)增出160bp條帶則為純合Piz-t 基因型，其余等位基因類型擴(kuò)增條帶為221bp，而雜合型則同時(shí)具有兩條條帶，并且三者還 會(huì)有一條331bp的共有條帶。因此該方法簡(jiǎn)便快速、成本低廉，可廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助 選擇育種或者水稻種質(zhì)資源Piz-t基因型鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物，分 別為：AF :TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ;AR :ATGGCAAATGAACTAAAGG ;GF :GGTCC TCTGCATGGTATG ; GR :AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。引物特異性好，擴(kuò)增效率高，可用于水稻抗稻瘟病基因 Piz-t的基因型鑒定。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物 的應(yīng)用，利用該引物可以有效的對(duì)抗稻瘟病基因 Piz-t進(jìn)行基因型選擇，既可以用于水稻 資源的篩選鑒定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因 Piz-t的分子育種。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)措施：
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案采取以下思路：Piz-t位于水稻第6號(hào)染色體的短臂，CDNA全長(zhǎng) 3335b p，含有兩個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別是3839bp和116bp，并且在該位點(diǎn)Piz-t還具有Pi9、 Pi-z、P i-2這3個(gè)抗病等位等位基因以及1個(gè)沒(méi)有功能的感病等位基因，因此通過(guò)尋找 Piz-t特異性序列或堿基并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增是區(qū)分Piz-t與其余等位基因的最好方 法。
[0009] 通過(guò)對(duì)4個(gè)抗性等位基因及1個(gè)感病基因的基因組編碼區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)并沒(méi) 有發(fā)現(xiàn)Piz-t特異性序列或者堿基，因此我們通過(guò)設(shè)計(jì)引物在Piz-t編碼區(qū)的上下游通 過(guò)Chromosome Walk ing的方法對(duì)Piz-t來(lái)源材料基因組進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增、測(cè)序，將獲得 序列首先與包含感病等位基因的材料Nipponbare及9311的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)（因?yàn)?Nipponbare與9311是已測(cè)序品種，全基因序列均可獲得），對(duì)于具有差異序列的位點(diǎn)再利 用包含其余3個(gè)等位基因的材料進(jìn)行測(cè)序比對(duì)確認(rèn)，最終在Piz-t下游15387bp處獲得一 個(gè)Piz-t特異性SNP位點(diǎn)，Piz-t等位基因型為A堿基，其余基因型均為G堿基；因此，通過(guò) 設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)該SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增即可實(shí)現(xiàn)Piz-t等位基因的鑒定。
[0010] 引物設(shè)計(jì)原理如下（圖1):在設(shè)計(jì)A型等位基因鑒定引物時(shí)，根據(jù)PCR-CTPP方法 原理，首先以該SNP位點(diǎn)的A堿基作為3'端在該位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)正向引物AF(表1)，在下游 設(shè)計(jì)反向引物AR，理論上AF的3'端的A堿基與A型等位基因材料正常結(jié)合擴(kuò)增而與G型 材料形成A/C錯(cuò)配無(wú)法擴(kuò)增，而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該錯(cuò)配并不能區(qū)分兩種基因型，在G型 材料中也有較微弱的擴(kuò)增，因此為增強(qiáng)該引物特異性我們?cè)贏F的倒數(shù)第三位引入了一個(gè) 錯(cuò)配堿基A增強(qiáng)其特異性，結(jié)果表明該引物只有與A型等位基因材料擴(kuò)增時(shí)有一條160bp 條帶，與G型材料沒(méi)有條帶擴(kuò)增；同理，按照上述思路開(kāi)發(fā)出擴(kuò)增G型等位基因材料的GF與 GR ;4條引物名稱、序列、Tm值及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1所示。
[0011] 我們接著做了一個(gè)PCR擴(kuò)增退火溫度的梯度及引物濃度梯度測(cè)試（圖2)，退火溫 度分別為55°C、57°C和59°C，由于PCR-CTPP方法中一般將外引物（即GF、AR)濃度設(shè)置為 內(nèi)引物（即GR、AF)濃度的一半，我們也設(shè)置了 3個(gè)不同的引物濃度比：AF、AR、GF與GR濃 度比分別為I: I: I: I、I. 5:1:1:2以及2:1:1:1. 5,結(jié)果表明在退火溫度為55°C引物濃度比 為1:1:1:1時(shí)擴(kuò)增條帶清晰。
[0012] 水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0013] 1)水稻DNA的提取
[0014] 2)合成表1所示的引物序列。
[0015] 3) PCR 擴(kuò)增
[0016] PCR反應(yīng)體系為 20 yL，含 2. 0 yL lOXBuffer，I. 0 yL dNTPs(10mmol/L)，4 條引 物均為 0· 2 μ M，0· 2 μ L Taq 酶（5U/ μ L)，2. 0 μ L 模板 DNA，12. 8 μ L ddH20 ;PCR 反應(yīng)程序： 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果。
[0017] 4.結(jié)果判斷
[0018] 4條引物AF、AR、GF與GR等量混合擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶類型判斷基因型，SNP位點(diǎn) 為A堿基的Piz-t型等位基因材料擴(kuò)增出160bp和331bp 2條條帶，SNP位點(diǎn)為G堿基的其 它等位基因材料擴(kuò)增出221bp和331bp 2條條帶，AG雜合型則擴(kuò)增出160bp、221bp和331bp 的3條條帶。331bp的共有條帶擴(kuò)增不明顯或不穩(wěn)定，但對(duì)本方法的結(jié)果判定無(wú)任何影響。
[0019] 表1引物序列
[0020]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物，分別為：AF : TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ；AR ：ATGGCAAATGAACTAAAGG ；GF ：GGTCCTCTGCATGGTATG ；GR ： AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC 〇
2. -種對(duì)水稻抗稻瘟病基因的鑒定方法，包括： 利用 AF ：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ；AR ：ATGGCAAATGAACTAAAGG ；GF ： GGTCCTCTGCATGGTATG ;GR :AGGAGAGATAGAACAITGTTGTAAC，對(duì)水稻 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；純合 產(chǎn)辦-纟基因型擴(kuò)增出160bp和331bp條帶，其余等位基因類型擴(kuò)增條帶為221bp和331bp條 帶，雜合型的擴(kuò)增條帶為160bp、221bp和331bp條帶。
3. 權(quán)利要求1所述的引物在水稻抗稻瘟病基因分子育種中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的引物在水稻資源的篩選鑒定中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性SNP分子標(biāo)記引物及應(yīng)用。申請(qǐng)人通過(guò)將不同等位基因測(cè)序及序列比對(duì)鑒定到一個(gè)Piz-t特異性SNP位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)了一套鑒定該SNP的分子標(biāo)記引物，分別為：AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCCTCTGCATGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。利用該引物對(duì)水稻DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可快速判斷待測(cè)水稻Piz-t的基因型。方法簡(jiǎn)便快速、成本低廉，可廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種或者水稻種質(zhì)資源Piz-t基因型鑒定。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104611332
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510039800
【發(fā)明人】蔡海亞, 游艾青, 徐得澤, 周雷, 程建平, 閘雯俊, 李三和, 焦春海
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日