一種豬腦心肌炎病毒納米pcr檢測試劑盒及其檢驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬腦心肌炎病毒的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬腦心肌炎（Porcine encephalomyocarditis)是由腦心肌炎病毒 (Encephalomyocarditis virus, EMCV)引起的一種以腦炎、心肌炎和母豬繁殖障礙為主要 特征的人獸共患傳染病。自從1958年從患心肌炎的病豬中分離到EMCV以來，隨后世界上 一些養(yǎng)豬國家都曾有該病的發(fā)生、流行以及EMCV感染的報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì) 損失。我國從病原學(xué)和血清學(xué)方面已經(jīng)證實(shí)在不少養(yǎng)豬生產(chǎn)地區(qū)的規(guī)?；i場存在EMCV 的感染，對養(yǎng)豬生產(chǎn)潛在的危害受到關(guān)注。
[0003] EMCV的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的病毒的分離、免疫熒光抗體染色、聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)等，這些方法在病毒檢測中發(fā)揮了重要作用。其中PCR檢測方法由于操作簡單，靈 敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中，PCR技術(shù)存在諸多局限性，例如對 復(fù)雜體系的擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增以及擴(kuò)增效率不夠高等問題。為解決以上問題， 尋找可以提高PCR特異性和效率的添加劑顯得極其重要。
[0004] 納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，其原理是把粒徑為lnm~100nm的固相納米 金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性，因此在添加了 納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中，PCR反應(yīng)會(huì)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的停 留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，減少非特性擴(kuò)增，提高特異性擴(kuò)增產(chǎn) 量。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒的納米PCR檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米 PCR試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒， 包括5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于 所述試劑盒還包括2XNan〇PCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ ID No. 1所示，所述下游引物的序列為SEQ ID No. 2所示。
[0007] 引物是根據(jù)GenBank公布的豬腦心肌炎病毒序列，在其3D基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì) 的一對特異性引物。
[0008] 優(yōu)選的，2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 組 成。
[0009] 優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0010] 優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQ ID No. 2所示。
[0011] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括RNA提取試劑：TRIzol LS Reagent、氯仿、異丙醇、75% 乙醇。
[0012] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陽性對照。
[0013] 其中，陽性對照可為將豬腦心肌炎病毒接種BHK-21細(xì)胞后，收集24~48小時(shí)細(xì) 胞培養(yǎng)物。
[0014] 本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備檢測待測樣品中是否含有豬腦心肌炎病毒 的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0015] 應(yīng)用所述試劑盒檢測待測樣品中是否含有豬腦心肌炎病毒的方法，包括如下步 驟： 1、病毒RNA的提取 (1)將250 ii L經(jīng)過預(yù)處理的待測樣品加入750 ii L TRIzol LS Reagent中，劇烈振蕩 2 min，室溫放置5 min。加入250 iiL氯仿，劇烈振蕩lmin，室溫放置5min后，4°C 12,000 rpm離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管。（2)加入與水相等體積的異丙醇，混勻，室溫 靜置15 min, 4°C 12, 000 rpm離心15 min,輕輕倒去上清，然后加入DEPC處理的75%乙醇 700~800111，41：12,000卬111離心5 111111，棄上清。（3)將沉淀自然風(fēng)干或于501：干燥箱 中晾干，用適量無核酸酶水充分溶解后立即進(jìn)行PCR或貯存于-80°C備用。
[0016] 待測樣品可為腦、心臟、淋巴結(jié)。其中，待測樣品預(yù)處理的方法為：將待測樣品剪碎 后，按照1:5的質(zhì)量體積比加入生理鹽水并研磨均勻，3000~5000rpm離心5~10分鐘后 取上清，之后再進(jìn)行RNA的提取。
[0017] 2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取上述步驟所得的病毒總RNA 11 iiL，加入2 iiL 10剛的反轉(zhuǎn)錄引物（SEQ ID No. 2)， 4 U L 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 5 ii L反轉(zhuǎn)錄酶、0. 5 ii L RNA酶抑制劑、2 ii L dNTP Mixture 至20 ii L，42°C水浴1~2 h，即得到cDNA溶液。
[0018] 3、納米PCR反應(yīng) 在反應(yīng)管中加入10 yL2XNanoPCRMix、l ilL上述cDNA溶液、0.5 ilLlO剛的上游 引物（SEQ ID No. 1)、0. 5 iiL 10MM的下游引物（SEQ ID No. 2)，最后加入無核酸酶水至總 體積為20 u L。
[0019] 混勻后按如下反應(yīng)程序進(jìn)行：94°C 3min，l個(gè)循環(huán)；94°C 10s，56°C 30 s，72°C 25 s，共30個(gè)循環(huán)；72°C 5 min 1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，若出現(xiàn)425 bp大小的條帶則待測樣品含有豬腦心肌炎病毒。
[0020] 本發(fā)明提供了一對檢測豬腦心肌炎病毒的特異性引物，利用其制成的納米PCR試 劑盒，能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒。本發(fā)明可使PCR反應(yīng)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度， 減少了在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，大大提高 了豬腦心肌炎病毒的檢測效率，并有效提高了豬腦心肌炎病毒的特異性擴(kuò)增產(chǎn)量，減少了 非特異性擴(kuò)增，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1為豬腦心肌炎病毒納米PCR檢測結(jié)果； M :DL2000 Marker ; 1 :陽性對照； 圖2為豬腦心肌炎病毒納米PCR敏感性檢測結(jié)果； M: DL2000 Marker ;1~6依次為10°~1(T5倍比稀釋病毒核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物；7:陰性對 眧. >、、、? 圖3為豬腦心肌炎病毒納米PCR特異性檢測結(jié)果。
[0022] M:DL2000 Marker ;1:豬腦心肌炎病毒；2:豬瘟病毒；3:豬捷申病毒；4 :豬腸道 病毒；5 :豬繁殖與呼吸綜合征病毒；6 :陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所 給出的例子。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例 中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 實(shí)施例1 一種檢測豬腦心肌炎病毒的納米PCR試劑盒最佳實(shí)施例 本實(shí)施例試劑盒包括：（1)豬腦心肌炎病毒RNA提取試劑：TRIzol LS Reagent、氯仿、 異丙醇、75%乙醇；（2)反轉(zhuǎn)錄試劑：5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、濃度為2. 5 mM的dNTP Mixture、濃 度為2. 5 U/iiL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為30 U/iiL的RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物；（3) 納米PCR反應(yīng)試劑：2XNanoPCR Mix、上游引物、下游引物；（4)其他：陽性對照和無核酸 酶水。其中，2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 組成，陽 性對照為將豬腦心肌炎病毒接種接種BHK-21細(xì)胞后，收集24~48小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物，引物 為凍干粉，HPLC純。本實(shí)施例試劑盒包含的引物序列見表1。
[0025] 表1引物序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，包括5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括2 XNanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ ID No. 1所示，所述下游引物的序列 為 SEQ ID No. 2 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，其特征在于所 述 2XNanoPCR Mix 由 DNA 聚合酶、2XNanoPCR buffer 和 dNTP Mixture 組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，其特征在于所 述反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，其特征在于所 述反轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQ ID No. 2所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，其特征在于所 述試劑盒還包括RNA提取試劑：TRIzol LS Reagent、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，其特征在于所 述試劑盒還包括陽性對照。
7. 如權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備檢測待測樣品中是否含有豬腦心肌 炎病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬腦心肌炎病毒納米PCR檢測試劑盒及其檢驗(yàn)方法。所述試劑盒包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列為SEQ ID No.1所示，下游引物的序列為SEQ ID No.2所示。該試劑盒可用于檢測豬腦心肌炎病毒。本發(fā)明還提供了一種采用前述試劑盒進(jìn)行豬腦心肌炎病毒檢測的方法，能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒，大大提高了豬腦心肌炎病毒的檢測效率及豬腦心肌炎病毒的特異性擴(kuò)增產(chǎn)量。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93
【公開號(hào)】CN104673937
【申請?zhí)枴緾N201510096905
【發(fā)明人】袁萬哲, 孫繼國
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月5日