一種制備漆酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地涉及利用一株虎皮香燕（Lentinus tigrinus)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅 藍(lán)蛋白屬銅藍(lán)氧化酶（blue copper oxidases)家族中的同一小族。漆酶按其來(lái)源可以分 為漆樹(shù)漆酶（rhus laccase)和真菌漆酶（fungal laccase)兩大類(lèi)，植物漆酶與木質(zhì)素的 生物合成密切相關(guān)，真菌漆酶具有多種生理生化功能，如形態(tài)發(fā)生，真菌與植物寄主相互作 用，應(yīng)激防御以及木質(zhì)素降解等。據(jù)統(tǒng)計(jì)漆酶的催化底物多達(dá)250多種，主要有酚類(lèi)、芳胺、 羧酸、金屬有機(jī)化合物以及一些留類(lèi)激素和生物色素。由于作用底物廣泛，漆酶在食品工 業(yè)、廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、有機(jī)合成、木材加工、免疫檢測(cè)等諸多領(lǐng)域有 廣泛應(yīng)用。
[0003] 己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有多種產(chǎn)漆酶的側(cè)耳類(lèi)真菌，如糙皮側(cè)耳、刺芹側(cè)耳、環(huán)柄側(cè)耳等， 但漆酶酶活普遍不高。發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN200910083514. 7 "一種漆酶及其制備方法與 專(zhuān)用生產(chǎn)菌株"，其生產(chǎn)菌株為血紅密孔菌，漆酶發(fā)酵酶活為300U/mL;發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng) CN101942421B"一種竹黃菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法"，漆酶發(fā)酵酶活為500U/mL;發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng) CN200810198678.X"一種產(chǎn)漆酶的靈芝菌株"，漆酶發(fā)酵酶活為8620U/mL，是目前酶活較高 的菌株。上述發(fā)明的菌種不屬于食用菌。
[0004] 虎皮香菇，屬傘菌目，側(cè)耳科，香菇屬，生于闊葉樹(shù)腐木上，易于進(jìn)行固體栽培和液 體深層發(fā)酵培養(yǎng)，具有生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)物產(chǎn)量高，是一種食用真菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用食用菌制備漆酶的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] -種制備漆酶的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)將接種虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏編號(hào)：CGMCCNo.8301的斜面培養(yǎng) 基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基，在25~35°C，搖床150~200rpm，培養(yǎng)2~5天，制 備種子液；
[0009] (2)將種子液按體積比為2%~14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 是在500mL三角瓶中的裝液量為100~250mL，在25~35°C、搖床150~350rpm培養(yǎng)7~ 20天，得到虎皮香菇菌絲體發(fā)酵液；
[0010] (3)將菌絲體發(fā)酵液于lOOOOXg離心lOmin，取上清液即為漆酶粗酶液。
[0011]步驟（1)優(yōu)選為：將接種虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏編號(hào)：CGMCC No. 8301的斜面培養(yǎng)基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基，在28~32°C，搖床150~ 200rpm，培養(yǎng)3~4天，制備種子液。
[0012]步驟（2)優(yōu)選為：將種子液按體積比為6%~14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，所 述發(fā)酵培養(yǎng)基是在500mL三角瓶中的裝液量為150~200mL，在28~32°C，搖床150~ 200rpm，培養(yǎng)9~15天，得到虎皮香燕菌絲體發(fā)酵液。
[0013] 斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為：葡萄糖5~40g/L，蛋白胨2. 5~20g/L，酵母粉0? 5~5g/L， 瓊脂10~20g/L，其余為花生殼浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼10~ 200g，水1L，煮沸30~60min，過(guò)濾，濾液即是花生殼浸出液。
[0014] 液體種子培養(yǎng)基為：玉米粉10~50g/L、豆柏粉5~35g/L、a-淀粉酶20~80U/ L、KH2P040. 5 ~6g/L、MgS04 ? 7H200. 2 ~5g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0015] 液體種子培養(yǎng)基較好的是：玉米粉25~35g/L、豆柏粉10~20g/L、a-淀粉酶 30 ~65U/L、KH2P042 ~4g/L、MgS04 *7H201 ~2g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源20~100g/L，氮源5~60g/L，KH2P041~5g/L， MgS04 ? 7H200. 25 ~3g/L，CuS04 ? 5H200. 5 ~2mmol/L，其余為水。
[0017] 碳源選自以下一種或幾種：葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糊精、麥芽糖或玉米粉。
[0018] 氮源選自以下一種或幾種：酵母浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、低溫黃豆餅粉、磷酸二氫 銨或硫酸銨。
[0019] 最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氫銨lg/ L，KH2P042g/L，MgS04 ? 7H200. 25g/L，CuS04 ? 5H201mmol/L，其余為水。
[0020] 本發(fā)明利用一種食用菌虎皮香燕（Lentinustigrinus)保藏編號(hào)：CGMCC No. 8301，通過(guò)液體深層發(fā)酵高產(chǎn)食品級(jí)的漆酶。本發(fā)明虎皮香菇發(fā)酵液中漆酶的酶活高， 發(fā)酵液中漆酶酶活最高可達(dá)462. 59U/mL。且漆酶反應(yīng)的適應(yīng)條件較廣，在溫度40~60°C 范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，在40°C時(shí)酶活最高，最適pH為4. 4~4. 8,酶活均在90%以上，最適pH為 4. 6。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為虎皮香菇平板培養(yǎng)照片。
[0022] 圖2為虎皮香菇菌絲體照片。
[0023] 圖3為純化后的漆酶電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
[0025] 試驗(yàn)中所用的主要試劑和儀器如下：玉米粉--梅河口市興達(dá)米業(yè)有限責(zé)任公 司；低溫黃豆餅粉--山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；淀粉酶--北京索萊寶科技有 限公司；果糖--河北華旭制藥有限責(zé)任公司；胰蛋白胨--北京雙旋微生物培養(yǎng)基制 品廠；2, 2'-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鈉）（ABTS)--SIGMA公司；紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)--TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；低溫恒溫循環(huán)器-- ILB-008-01型，施都凱儀器設(shè)備(上海）有限公司。
[0026] 本發(fā)明所用食用菌虎皮香菇（Lentinustigrinus)于2013年10月9日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，并已存活，建議的分類(lèi)命名為虎皮香燕（Lentinustigrinus), 保藏編號(hào)CGMCCNo. 8301，虎皮香菇平板培養(yǎng)照片見(jiàn)圖1，虎皮香菇菌絲體照片見(jiàn)圖2。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，瓊脂15g/L，其余為花生殼 浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼l〇〇g，水1L，煮沸45min，過(guò)濾，濾液即 是花生殼浸出液。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉3g/L，瓊脂15g/L，其余為花生殼 浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼l〇g，水1L，煮沸60min，過(guò)濾，濾液即是 花生殼浸出液。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖15g/L，蛋白胨2. 5g/L，酵母粉5g/L，瓊脂15g/L，其余為花生 殼浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼l〇〇g，水1L，煮沸50min，過(guò)濾，濾液 即是花生殼浸出液。
[0033] 實(shí)施例4
[0034] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉0. 5g/L，瓊脂20g/L，其余為花生 殼浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼150g，水1L，煮沸40min，過(guò)濾，濾液 即是花生殼浸出液。
[0035] 實(shí)施例5
[0036] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉2g/L，瓊脂10g/L，其余為花生殼 浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼200g，水1L，煮沸30min，過(guò)濾，濾液即 是花生殼浸出液。
[0037] 實(shí)施例6
[0038] 液體種子培養(yǎng)基：玉米粉30g/L、豆柏粉15g/L、a-淀粉酶45U/L、KH2P043g/L、 MgS04 ? 7H201. 5g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0039] 實(shí)施例7
[0040] 液體種子培養(yǎng)基：玉米粉25g/L、豆柏粉20g/L、a-淀粉酶30U/L、KH2P044g/L、MgS04 ? 7H201g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0041] 實(shí)施例8
[0042] 液體種子培養(yǎng)基：玉米粉35g/L、豆柏粉10g/L、a-淀粉酶65U/L、KH2P042g/L、 MgS04 ? 7H202g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0043] 實(shí)施例9
[0044] 液體種子培養(yǎng)基：玉米粉10g/L、豆柏粉35g/L、a-淀粉酶20U/L、KH2P046g/L、 MgS04 ? 7H200. 2g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0045] 實(shí)施例10
[0046] 液體種子培養(yǎng)基：玉米粉50g/L、豆柏粉5g/L、a-淀粉酶80U/L、KH2P040. 5g/L、 MgS04 ? 7H205g/L，其余為水，pH自然，0?IMPa滅菌 25min。
[0047] 實(shí)施例11
[0048] 發(fā)酵培養(yǎng)基：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氫銨lg/L， KH2P042g/L，MgS04 ? 7H200. 25g/L，CuS04 ? 5H201mmol/L，其余為水。
[0049] 實(shí)施例12
[0050] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖60g/L，蛋白胨8g/