使用突變的胱硫醇γ-合酶從O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇制備L-甲硫氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于制備L-甲硫氨酸的方法，其中0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通 過酶轉化為L-甲硫氨酸和H3P04。所述轉化通過稱為依賴0-磷酸-L-高絲氨酸（0HPS)的 甲硫氨酸合酶的酶實現。本發(fā)明還提供了依賴〇-磷酸-L-高絲氨酸的甲硫氨酸合酶，即能 夠將〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉化為L-甲硫氨酸和H 3P〇d9蛋白質。本發(fā)明還 涉及已經過基因修飾從而能從0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇制備L-甲硫氨酸的微生物。
[0002] 所述酶和方法也能有利地用于合成甲硫氨酸的衍生物如S-腺苷甲硫氨酸、谷胱 甘肽、半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸和甲硫腺苷。本發(fā)明還提供了篩選催化0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇至L-甲硫氨酸和H 3P04轉化的酶的方法。
【背景技術】
[0003] L-甲硫氨酸是源自從通過激活L-天冬酰磷酸接著還原至L-天冬氨酸半醛和 L-高絲氨酸的L-天冬氨酸的代謝中必需的氨基酸。在細菌以及真菌中，L-高絲氨酸經過 0-乙?；饔脕硇纬社牾ｕセ蛞阴ｕ?，所述酯本身經過直接用硫化物（SH 2)的硫縮合作 用以形成L-高半胱氨酸或在轉化為高絲氨酸之前間接用L-半胱氨酸以形成L-光硫醚。接 著使用甲基四氫葉酸使高半胱氨酸甲基化以形成甲硫氨酸。
[0004] 在植物中，作為胱硫醚前體使用的L-高絲氨酸酯為0-磷酸-L-高絲氨酸。通過 胱硫醚0裂合酶的作用，之后將胱硫醚轉化為高半胱氨酸。高半胱氨酸的甲基化之后形成 甲硫氨酸。〇-磷酸-L-高絲氨酸也存在于通過磷酸-吡哆醛酶蘇氨酸合酶（EC 4. 2. 3. 1) 作用的細菌、植物、真菌和哺乳細胞的代謝中，作為L-蘇氨酸的直接前體。在植物中，存在 嚴格的調控功能從而將碳通量在〇-磷酸-L-高絲氨酸分叉點控制在蛋氨酸和蘇氨酸（Amir 等，TRENDS Plant Science 7(2002)，153)。文獻（詳見例如 Kreft 等，Plant Physiol， 104 (1994)，1215 ;Ravanel 等，Arch. Biochem.Biophys. 316 (1995)，572)中已報道 了隨著 0-磷酸-L-高絲氨酸轉化為L-胱硫醚和L-高半胱氨酸，同時釋放磷酸，L-半胱氨酸和硫 化物（SH 2)都可以通過植物胱硫醚Y合酶縮合。還報道了非常限制硫基底物的范圍，除了 L-半胱氨酸，只有少數底物能被接受。
[0005] 雖然其為必需的氨基酸，在動物中，甲硫氨酸并不是初始合成的，動物必須攝取甲 硫氨酸或包含甲硫氨酸的蛋白質或相關的含硫化合物。特別地，甲硫氨酸對于家禽和牲畜 喂養(yǎng)是必需的并在家禽和牲畜食用的蔬菜中存在量不足。有效飼養(yǎng)因而需要外部甲硫氨酸 供應。至今，如果并非全部那么絕大多數用于喂養(yǎng)動物的甲硫氨酸源自石油化工。制備甲 硫氨酸的一個局限在于還原硫消耗的能量成本。因此，需要能提供其他制備此氨基酸的途 徑，優(yōu)選通過使用可再生來源，其能允許使用微生物，在所使用的微生物中甲硫氨酸的合成 適應工業(yè)規(guī)模生產。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明通過提供用于制備L-甲硫氨酸的方法來說明此需要，所述方法中0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉化為L-甲硫氨酸和H3P04。在所述方法中，硫的來源是 甲硫醇。在此化合物中，硫通過已經還原的硫化物提供。此外，與取決于使用乙?；幕蜱?珀?；母呓z氨酸衍生物的標準代謝途徑相比，使用〇-磷酸-L-高絲氨酸作為前體，每分 子合成的甲硫氨酸節(jié)省了至少兩個碳原子?？傮w而言，此途徑在合成甲硫氨酸及其衍生物 中允許較佳產量。
[0007] 因此，本發(fā)明涉及用于制備L-甲硫氨酸的方法，其中L-甲硫氨酸按照以下反應方 案通過酶制備：
[0008] 0-磷酸-L-高絲氨酸+CH3-SH〈 = >L-甲硫氨酸+H3P04
[0009]目前沒有報告表示天然存在具備將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫 氨酸的能力的蛋白質。本發(fā)明的發(fā)明人考慮以節(jié)省成本的方法從〇-磷酸-L-高絲氨酸和 甲硫醇制備L-甲硫氨酸的選擇并為此目的，設計不是天然存在的并具有將0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸的蛋白質。從所附實施例顯而易見，本發(fā)明的發(fā)明人開 發(fā)的體系允許制備具有將〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-高絲氨酸和H 3P04的能 力的酶。此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經成功通過引用此體系產生新的酶變體，所述酶變體衍生 自已存在的酶，所述酶突變體具有將0-磷酸-L -高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-高絲氨酸和 H3P04的能力。為此目的，其從已存在的未顯示將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲 硫氨酸和成?0 4的能力的酶開始，從所述存在的酶制備突變體并選擇顯示將0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04的能力的酶。因此，本發(fā)明的發(fā)明人能確定之 前并未描述過的新的酶活性并提供用于制備相應酶的可靠的并可再生的方法。在本發(fā)明的 上下文中，相應的酶指依賴〇-磷酸-L-高絲氨酸的甲硫氨酸合酶。
[0010] 因此，本發(fā)明特別涉及用于制備L-甲硫氨酸的方法，其中0-磷酸-L-高絲氨酸和 甲硫醇按照以下反應方案通過酶轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04:
[0011] 0-磷酸-L-高絲氨酸+CH3-SH〈 = >L-甲硫氨酸+H3P04其中通過酶的轉化通過使 用依賴〇-磷酸-L-高絲氨酸的甲硫氨酸合酶實現。
[0012] 原則上，任意依賴0-磷酸-L-高絲氨酸的甲硫氨酸合酶，即，任意具有將0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和11 3?04的能力的蛋白質可用于根據本發(fā)明的 方法。本發(fā)明首次描述了顯示此能力的蛋白質并提供了用于提供其他顯示此能力的蛋白質 的方法。特別地，本發(fā)明公開了有可能從天然不具備將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化 為L-甲硫氨酸的能力的植物胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)，通過突變和選擇制備具有此能 力的變體。
[0013] 將在下文根據本發(fā)明的蛋白質的部分中進一步描述依賴0-磷酸-L-高絲氨酸的 甲硫氨酸合酶并且在根據本發(fā)明的方法中，可以使用任意所述的依賴〇-磷酸-L-高絲氨酸 的甲硫氨酸合酶。
[0014] 從所附實施例中顯而易見，本發(fā)明的發(fā)明人成功制備了顯示出將0-磷酸-L-高絲 氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04的能力的幾種不同的蛋白質。這些蛋白質的序列 在SEQ ID No :6至29中顯示。這些蛋白質通過如實施例中描述的來自植物胱氨酸y合酶 (EC 2.5. 1.48)的篩選體系中的突變和選擇制備，所述胱氨酸Y合酶天然不具備將〇-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸的能力。
[0015] 此外，從SEQ ID No :6至29中顯示的序列，有可能提供其他保留了將0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和恥04的活性的蛋白質。例如，有可能進一 步增加蛋白質與底物〇-磷酸-L-高絲氨酸和/或至底物甲硫醇的親和性或改進如下進一 步描述的蛋白質的其他特性。因此，在根據本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，〇-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇通過酶轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04通過使用蛋白質實現，所述蛋白質選自 組成如下的群組：
[0016] (a)包括SEQ IDNo:6至29中任一個所示的氨基酸序列的蛋白質；和
[0017] (b)具備與SEQ ID No :6至29中任一個至少60%的序列等同性并具有將0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶活性的蛋白質。
[0018] 將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶活性可以例如 通過所附實施例中描述的試驗評估。為此目的，例如，有可能使具有甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型表 型的釀酒酵母（S.cerevisiae)菌株。此類菌株的例子是其中高絲氨酸轉乙酰酶和高半胱 氨酸合酶被移除或使其機能障礙的菌株。優(yōu)選地，將兩種酶全部移除或使其全部機能障礙。 如圖1所示，釀酒酵母取決于必須使用的0-乙?；?高絲氨酸來合成高半胱氨酸，高半胱 氨酸之后被轉化為甲硫氨酸。所述酶，負責合成〇-乙酰基高絲氨酸的高絲氨酸轉乙酰酶由 MET2基因編碼。在MET2失去活性后，高絲氨酸不能再被轉化為0-乙?；呓z氨酸并且所 有的高絲氨酸通量向磷酸高絲氨酸轉化。由于MET2催化反應是酵母中僅有的0-乙?；?絲氨酸來源，MET2基因的失活導致了酵母菌株表現為嚴格的甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型表型。但 是，高半胱氨酸（最后的甲硫氨酸前體）可衍生自半胱氨酸（通過轉硫作用途徑）或衍生 自S-腺苷甲硫胺酸的再循環(huán)。為了確保完全不會合成甲硫氨酸，MET6,編碼負責從高半胱 氨酸和甲基四氫葉酸合成甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基轉移酶的基因也被刪除。
[0019] 因此，在用于檢測蛋白質將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和 恥0 4的能力的試驗中，可以優(yōu)選使用釀酒酵母菌株，其中將MET2和/或MET6基因刪除或 破壞，優(yōu)選將兩者都刪除或破壞。雙met2Amet6△破壞的菌株不能在沒有甲硫氨酸的存在 下生長并且特別不能在甲硫醇作為硫源存在下生長。所述菌株不再能合成0-乙?；呓z 氨酸但是產生〇-磷酸-高絲氨酸?？梢灾髮⒋祟惤湍妇暧镁幋a蛋白質的核酸分子轉 化，待測所述蛋白質將〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-高絲氨酸和成?0 4的能力。 所述菌株在介質中/上生長，所述介質包含甲硫醇作為唯一的硫源并且在此類介質上的生 長能力表示表達的蛋白質能將0-磷酸-L-高絲氨酸（0HPS)和甲硫醇轉化為L-高絲氨酸 和H 3P04。甚至更優(yōu)選使用其中編碼蘇氨酸合酶的基因也例如通過刪除或破壞而機能障礙 的菌株。在met2A met6A菌株中，在通過THR1基因編碼的高絲氨酸激酶催化的反應中合 成0PHS，但由于0PHS通過THR4基因編碼的蘇氨酸合酶活性轉化為蘇氨酸，0PHS不可能充 分聚集。所述三方1^七2八!11的6八也4八突變體菌株因而允許檢測非常低的依賴〇即5的甲 硫氨酸合酶的活性并已經用作細胞的首次篩選來分離賦予依賴0HPS的甲硫氨酸合酶活性 的新的蛋白質。
[0020] 此酶的活性也可以進一步地通過體外的試驗確定，其中0-磷酸-L-高絲氨酸和 甲硫醇在體外適宜條件下用源自表達待測蛋白質的酵母菌株的非細胞提取物或用待測 的（部分地）純化的蛋白質培育，并且其中通過液相色譜/質譜/質譜（LC/MS/MS)，使用 C 13甲硫氨酸作為內部對照（Ravanel 等。Archives of Biochemistry and Biophysics 316 (1995)，572-584)檢測到甲硫氨酸的制備。
[0021] 在所述體外試驗中作為底物使用的0-磷酸-L-高絲氨酸可以通過例如圖2所示 的方法（Barclay 等，J. Chem. Soc，Chem. Com(1994) 815-816)提供。
[0022] 如上所述，顯示將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶 活性的蛋白質的例子是那些具備SEQ ID No :6至29中任一個所示的氨基酸序列的蛋白質。 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，根據本發(fā)明的方法使用包括SEQ ID No :6至29中任一個 所示的氨基酸序列的蛋白質。但是，當然也有可能使用這些蛋白質的變體，即蛋白質的氨基 酸序列顯示與SEQ ID No :6至29中任一個所示的氨基酸序列的高度序列等同性，并且其 顯示出將〇-磷酸-