一種磁珠法結(jié)合離心套管提取dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取DNA的方法，具體是采用磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物磁珠是一種新型的功能化固體載體，其表面包被有活性基團(tuán)，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性材料等特點(diǎn)，在外磁場(chǎng)的作用下可以定向移動(dòng)和集中，當(dāng)撤去外磁場(chǎng)后，稍加振蕩或抽吸又可均勻分散于液體中，從而使固液相的分離變的十分快捷方便，通過簡(jiǎn)單的洗脫可以得到純度很高的靶向物質(zhì)。
[0003]裂解液是一種蛋白變性劑，可使動(dòng)植物的細(xì)胞裂解，并使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，DNA游離釋放，磁球可以特異地吸附DNA，通過洗滌，去除DNA以外的RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再因洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA，得到純度和濃度均很高的DNA，可用于PCR擴(kuò)增、酶切、分子雜交等。
[0004]專利文獻(xiàn)CN102229927A公開的一種提取案件微量檢材DNA的方法:
[0005]I)將已轉(zhuǎn)移好的可能含有脫落細(xì)胞的載體置于離心管，并加入裂解液和蛋白酶，漩渦震蕩混勻，離心管置于孵育器上56度孵育40?60分鐘；
[0006]2)離心管漩渦震蕩混勻，置于孵育器上70-100度孵育3?8分鐘后，13000轉(zhuǎn)離心3分鐘；
[0007]3)轉(zhuǎn)移上清，加入磁珠懸液、結(jié)合液I和結(jié)合液II，吹打混勻，形成固液均相分散的懸濁液；
[0008]4)磁力架將吸附了 DNA的磁珠從固液均相分散的懸濁液中分離出；
[0009]5)清洗液洗滌吸附有DNA的磁珠2-3次，將磁珠上的雜質(zhì)洗去；
[0010]6)超純水解吸附磁珠上的DNA，獲得純的濃縮的DNA溶液。
[0011]以上這種方法在行業(yè)內(nèi)廣泛使用，其優(yōu)點(diǎn)是提取后的DNA模板純度高，基本無雜質(zhì)殘留，有利于PCR擴(kuò)增，對(duì)于血跡、煙頭等雜質(zhì)含量高、模板濃度高的常規(guī)檢材，提取效果好。但這種方法在微量檢材檢驗(yàn)時(shí)效果差，DNA面板損失量較大，損失率高達(dá)80-90%，檢出率低下。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，該提取方法適用于微量檢材的檢驗(yàn)。
[0013]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0014]一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，包括以下步驟:
[0015](I)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:2?3:2?3(優(yōu)選體積比10:2:2)混勻后，取160?200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37?56°C金屬浴上裂解20?30分鐘，95?99°C裂解10?15分鐘；
[0016]在本專利中，離心套管采用專利文獻(xiàn)CN103146569B公開的離心管，該離心管包括離心管和內(nèi)套管。
[0017]本步驟的目的是將DNA裂解，將DNA與蛋白質(zhì)分離，從細(xì)胞核中釋放出來。
[0018](2)將離心套管放入離心機(jī)中13000?17000g (優(yōu)選15000g)離心0.5?I分鐘，打開離心套管的管蓋加入吸附液200?300微升，再次放入離心機(jī)13000?17000g離心2?5分鐘；本步驟是利用具有過濾作用的離心套管去除載體和雜質(zhì)。
[0019](3)打開離心套管管蓋，去除內(nèi)套管，加入吸附液700?1000微升，加入磁珠懸濁液10?16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1000?1300轉(zhuǎn)吸附15?20分鐘；本步驟的目的是將水溶性DNA吸附在磁珠上。
[0020]上述吸附液優(yōu)選硫氰酸胍。
[0021](4)去除吸附液:將離心套管的離心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，再次吸去殘液；
[0022](5)加入-20°C冰乙醇600?800微升，充分渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，再次吸去殘夜；本步驟的目的是洗去殘留擴(kuò)增抑制物，如殘留吸附液。
[0023](6)置56°C金屬浴上烘干磁珠，加入洗脫液20?100微升，充分禍旋后，置56?60°C金屬浴上孵化15?20分鐘，將DNA從磁珠上釋放出來。
[0024](7)將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增，提高DNA模板產(chǎn)量。
[0025]本發(fā)明利用機(jī)械離心原理，使用離心套管將載體上的DNA充分移至離心管內(nèi)，并最大限度地過濾雜質(zhì)，保留DNA模板；加大吸附液的用量，(現(xiàn)有技術(shù)用量為300微升，本發(fā)明中用量在1200微升左右)，從而保證吸附液的濃度沒有明顯下降，從而保證磁珠能夠充分吸附DNA ;刪去現(xiàn)有技術(shù)中的漂洗步驟，不僅簡(jiǎn)化提取流程，更重要的是減少DNA模板損失；減少乙醇漂洗步驟，在充分吸取殘留物的基礎(chǔ)上，減少DNA模板損失；將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增，使磁珠上的殘留的DNA模板得到充分利用。
[0026]本發(fā)明方法檢出率高，最終模板保有量達(dá)50-70%，特別適用于微量檢材的檢驗(yàn)，可檢出模板含量在10pg以上的現(xiàn)場(chǎng)DNA檢材。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028](I)將手套印棉簽拭子置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K (10mg/ml)按體積比10:2:2混勻后，取200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置56 °C金屬浴上裂解20分鐘，99 °C裂解10分鐘；
[0029](2)將離心套管放入離心機(jī)中17000g離心30秒，打開離心套管的管蓋加入吸附液200微升，再次放入離心機(jī)15000g離心2分鐘；
[0030](3)打開離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠懸濁液10微升，置自動(dòng)渦旋儀上1300轉(zhuǎn)吸附15分鐘；
[0031](4)將離心套管的離心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置離心機(jī)內(nèi)SOOOg離心20秒，再次吸去殘液；
[0032](5)加入_20°C冰乙醇750微升，充分渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)6000g離心30秒，再次吸去殘夜；
[0033](6)置56°C金屬浴上烘干磁珠，加入洗脫液20微升，充分禍旋后，置56°C金屬浴上孵化15分鐘；
[0034](7)將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0035]提取結(jié)果:檢出1?板含星在10pg的手套印棉簽拭子。
[0036]實(shí)施例2
[0037](I)將網(wǎng)線插頭壓片剪入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K (10mg/ml)按體積比10:2:3混勻后，取160微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置56°C金屬浴上裂解20分鐘，95°C裂解15分鐘；
[0038](2)將離心套管放入離心機(jī)中15000g離心I分鐘，打開離心套管的管蓋加入吸附液200微升，再次放入尚心機(jī)13000g尚心5分鐘；
[0039](3)打開離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍700微升，加入磁珠懸濁液16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1000轉(zhuǎn)吸附20分鐘；
[0040](4)將離心套管的離心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置離心機(jī)內(nèi)8000g離心30秒，再次吸去殘液；
[0041](5)加入_20°C冰乙醇600微升，充分渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，再次吸去殘夜；
[0042](6)置56°C金屬浴上烘干磁珠，加入洗脫液80微升，充分禍旋后，置60°C金屬浴上孵化15分鐘；
[0043](7)將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0044]提取結(jié)果:檢出模板含量在lOOpg，檢出率在80%以上。
[0045]實(shí)施例3
[0046](I)將作案工具手柄擦拭子置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:3:3混勻后，取180微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37°C金屬浴上裂解30分鐘，99°C裂解10分鐘；
[0047](2)將離心套管放入離心機(jī)中13000g離心I分鐘，打開離心套管的管蓋加入吸附液300微升，再次放入離心機(jī)17000g離心2分鐘；
[0048](3)打開離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠懸濁液16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1200轉(zhuǎn)吸附18分鐘；
[0049](4)將離心套管的離心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，再次吸去殘液；
[0050](5)加入_20°C冰乙醇800微升，充分渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，再次吸去殘夜；
[0051](6)置56°C金屬浴上烘干磁珠，加入洗脫液100微升，充分禍旋后，置56°C金屬浴上孵化20分鐘；
[0052](7)將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0053]提取結(jié)果:檢出模板含量在lOOpg，檢出率在80%以上。
[0054]上述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:2?3:2?3混勾后，取160?200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37?56°C金屬浴上裂解20?30分鐘，95?99°C裂解10?15分鐘； (2)將離心套管放入離心機(jī)中13000?17000g離心0.5?I分鐘，打開離心套管的管蓋加入吸附液200?300微升，再次放入離心機(jī)13000?17000g離心2?5分鐘； (3)打開離心套管管蓋，去除內(nèi)套管，加入吸附液700?1000微升，加入磁珠懸濁液10?16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1000?1300轉(zhuǎn)吸附15?20分鐘； (4)將離心套管的離心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置離心機(jī)內(nèi)6000?SOOOg離心20?30秒，再次吸去殘液； (5)加入-20°C冰乙醇600?800微升，充分渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，再次吸去殘夜； (6)置56°C金屬浴上烘干磁珠，加入洗脫液20?100微升，充分禍旋后，置56?60°C金屬浴上孵化15?20分鐘； (7)將磁珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(I)中，所述體積比10:2:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(I)中，置56°C金屬浴上裂解20?30分鐘，99°C裂解10?15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(2)中，離心套管放入離心機(jī)中15000g離心。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:所述吸附液為硫氰酸胍。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磁珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，包括以下步驟：1)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K按體積比混勻后加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置金屬浴上裂解；2)加入吸附液再次離心；3)去除內(nèi)套管，加入吸附液，加入磁珠懸濁液置自動(dòng)渦旋儀上吸附；4)置于磁力架上吸去上清后置離心機(jī)內(nèi)離心再次吸去殘液；5)加入冰乙醇渦旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置離心機(jī)內(nèi)離心再次吸去殘夜；6)烘干磁珠，加入洗脫液充分渦旋后置金屬浴上孵化；7)PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增；本發(fā)明方法檢出率高，最終模板保有量達(dá)50-70％，特別適用于微量檢材的檢驗(yàn)，可檢出模板含量在100pg以上的現(xiàn)場(chǎng)DNA檢材。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號(hào)】CN104830833
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510232692
【發(fā)明人】齊潔麗
【申請(qǐng)人】上?；菸纳锛夹g(shù)有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月8日