一種降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌菌懸液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種降解多種鄰苯二甲 酸酯的壤霉菌菌懸液及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱。其中，鄰 苯二甲酸二丁醋（di_/?-butylphthalate，DBP)和鄰苯二甲酸二異辛醋（di_ (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)是兩種最廣泛使用的塑料增塑劑，在PVC塑料中其含量可達(dá)40~60%。近 幾十年來，我國塑料大棚和農(nóng)膜使用量急劇增加。隨著塑料薄膜的大量使用，越來越多的 DBP和DEHP被釋放進(jìn)入農(nóng)田土壤，它們已成為在農(nóng)田土壤中最常被檢出的有機(jī)污染物，檢 測級別達(dá)到mg/kg。研宄表明，這兩種鄰苯二甲酸酯具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變 性，以及生殖毒性，已被美國環(huán)境保護(hù)局（EPA)列為優(yōu)先控制污染物。因此，我國農(nóng)業(yè)土壤 中的DBP和DEHP污染問題亟待解決。
[0003] 由于這兩種鄰苯二甲酸酯的化學(xué)穩(wěn)定性很好，自然條件下通過光解、水解等化學(xué) 作用消失的速率非常緩慢，其半衰期長達(dá)20年之久，絕大部分的DBP和DEHP主要是通過 生物降解途徑從環(huán)境中消失。其中微生物降解具有成本低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu) 點(diǎn)，符合構(gòu)建環(huán)境友好型及資源節(jié)約型社會(huì)的要求與發(fā)展趨勢。因此，利用微生物的降解作 用將DBP和DEHP轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)是去除環(huán)境中鄰苯二甲酸酯污染的最佳手段。
[0004] 目前，國內(nèi)外學(xué)者已分別針對DBP和DEHP篩選出許多具有良好降解性能的菌株， 但其中能夠同時(shí)降解這兩種鄰苯二甲酸醋的菌株很少。壤霉菌sp.)是土壤中 廣泛存在的一類菌屬，目前有報(bào)道該菌屬的某些菌種具有可高效降解苯酚、農(nóng)藥噻蟲嗪及 耐重金屬的特性，但尚未見其可降解鄰苯二甲酸酯的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌 菌懸液。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌菌懸液的用途。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一種降解DBP和/或DEHP的菌懸液，通過以下方法制備得到：將純化后的壤霉菌 sp.)菌株MT-E接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌 體，用PBS洗菌后重懸調(diào)節(jié)0D6(KI M = 0. 6~1. 0作為菌懸液； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為 CCTCC M 2015054。
[0008] 優(yōu)選地，調(diào)節(jié)0D6(I(I ? = 0? 8作為菌懸液。
[0009] 優(yōu)選地，所述常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基或PDA液體 培養(yǎng)基。
[0010]優(yōu)選地，用PBS洗菌2~4次。
[0011] 如上所述菌懸液在修復(fù)DBP和/或DEHP污染介質(zhì)中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選地，所述介質(zhì)為土壤、水或空氣。
[0013] 一種降解DBP和/或DEHP的生物制劑，含有如上所述菌懸液和輔劑。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明從常年使用塑料大棚的農(nóng)田土壤中首次分離篩選獲得一株壤霉菌 sp.)菌株MT-E，該菌株可同時(shí)降解鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯；豐富了鄰苯 二甲酸酯降解菌的種質(zhì)資源庫，而且該菌株在土壤中分布廣泛，易于培養(yǎng)，適應(yīng)能力強(qiáng)；另 外通過土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)說明了該菌實(shí)際污染土壤的生物處理中將有巨大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015] 圖1為MT-E菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長形態(tài)特征。
[0016] 圖2為MT-E菌株的掃描電鏡照片。
[0017] 圖3為MT-E菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0018] 圖4為MT-E菌株對DBP和DEHP的降解動(dòng)力學(xué)及生長曲線。
[0019] 圖5為MT-E菌株對污染土壤中DBP和DEHP的降解效果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。本發(fā)明以下實(shí)施例 為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應(yīng)用思想，實(shí)施 方式中簡單參數(shù)的替換不能一一在實(shí)施例中贅述，但并不因此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，其 他任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應(yīng)被視為等 效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例中所述培養(yǎng)基配方如下： 無機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM，g/L) :K2HP04:5. 8, KH2P04:4. 5,（NH4)2S04:2. 0，MgCl 2:0. 16, CaCl 2: 0? 02, Na2Mo04 ? 2H20 :0? 0024, FeCl3:0. 0018, MnCl 2 ? 2H20 :0? 0015。最終 pH 為 7. 5。
[0022] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，加超純 水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7. 0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1. 5% (w/v)瓊脂粉。
[0023] 實(shí)施例1菌株的分離與鑒定 采集常年使用塑料大棚的農(nóng)田土壤，稱取5 g新鮮土壤樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，150 rpm培養(yǎng)3天后取5 mL污泥懸液加入含有100 mL DBP和DEHP (分別為50 mg/L)的MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，150 rpm培養(yǎng)7天后，每次按1 mL的接種量 連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高培養(yǎng)基中PAEs含量至1000 mg/L。然后將馴化10次的培 養(yǎng)液稀釋1〇3~1〇5涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養(yǎng)1~3天。待平板上長出單菌落后， 挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編號MT-E。然后將菌株接種于LB固體平板 上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)(見圖1)。由圖1可知，菌落呈暗黃色、扁平、濕潤、 邊緣不平整、擴(kuò)散生長，七天后幾乎鋪滿平板。
[0024] 掃描電鏡觀察鑒定：將純化后的菌株MT-E接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過夜 活化。吸取800 yL菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS溶液洗 菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入1 mL的2. 5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次 經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 y L PBS溶液洗菌3次。隨后將菌體分別在 30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個(gè)梯度約浸泡15 min，然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脫水過 程。經(jīng)過〇)2干燥后制片觀察。圖2可見在掃描電鏡下MT-E菌體呈短桿狀，長約0.8~1.5 微米，寬約〇. 3~ 0. 5微米。
[0025] 將MT-E菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，鑒定結(jié)果見表1。
[0026] 表1. MT-E菌株的生理生化特征鑒定
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降解DBP和/或DEHP的菌懸液，其特征在于，通過以下方法制備得到：將純化 后的壤霉菌)菌株MT-E接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收 集菌體，用PBS洗菌后重懸調(diào)節(jié)0D_M = 0. 6~1. 0作為菌懸液； 所述菌株于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCCM2015054。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌懸液，其特征在于，調(diào)節(jié)OD_M = 0. 8作為菌懸液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌懸液，其特征在于，所述常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基為LB液體 培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌懸液，其特征在于，用PBS洗菌2~4次。
5. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述菌懸液在修復(fù)DBP和/或DEHP污染介質(zhì)中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述介質(zhì)為土壤、水或空氣。
7. -種降解DBP和/或DEHP的生物制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所 述菌懸液和輔劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌菌懸液及其應(yīng)用，所述菌懸液是將純化后的MT-E菌株接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用PBS洗菌后重懸調(diào)節(jié)OD600 nm = 0.6~1.0作為菌懸液；所述菌株于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC M 2015054。該菌懸液能同時(shí)降解DBP和DEHP，該菌懸液在PAEs污染的土壤修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。CCTCC M 201505420150122
【IPC分類】B09C1-10, B01D53-84, C12N1-14, B01D53-72, C02F101-34, C12R1-645, C02F3-34
【公開號】CN104845891
【申請?zhí)枴緾N201510066106
【發(fā)明人】蔡全英, 莫測輝, 趙海明, 李彥文, 李慧, 杜歡, 向壘, 成玉婷
【申請人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年2月9日