利用人工合成mv1序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合成MV1序列 培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘鹿（Saccharum officinarum)是禾本科甘鹿屬植物，是我國最主要的糖料作物 和綠色能源作物，其生產(chǎn)不僅關(guān)系我國食糖安全，還能為綠色能源燃料乙醇的生產(chǎn)提供原 料。但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，甘蔗病蟲害等許多因素都制約甘蔗的生產(chǎn)，致使甘蔗生產(chǎn)遭受 巨大的經(jīng)濟(jì)損失。甘蔗花葉病是蔗區(qū)發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的甘蔗病害之一，它主要破 壞甘蔗葉片的葉綠體，嚴(yán)重制約其光合作用，從而使甘蔗的生長受到限制，造成產(chǎn)量降低 5 % -19 %、節(jié)間變短、品質(zhì)變劣和品種退化。
[0003] 甘蔗花葉病是由馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)甘蔗花葉病毒亞組的成員甘蔗花 葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高粱花葉病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV) 引起的。Potyvirus病毒基因組長約10kb，編碼一個多聚蛋白，經(jīng)自身編碼的蛋白酶降解形 成10個多肽，分別為PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。近年來，研宄者先 后將單一的CP及HC全序列基因?qū)氲礁收嶂?，并獲得了轉(zhuǎn)基因甘蔗，對甘蔗花葉病的抗性 明顯提高。但研宄表明，蔗區(qū)中花葉病毒的優(yōu)勢株系在自然條件下也會發(fā)生變化，并產(chǎn)生 新的株系。目前，世界蔗區(qū)至少存在有7個ScMV和SrMV病毒株系，包括屬于ScMV的株系 ScMV-A，B，D，E和屬于SrMV的株系SrMV-H，I，M。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基 因?yàn)榘袠?biāo)的轉(zhuǎn)基因改良顯然無法應(yīng)對蔗區(qū)病原株系多樣化、復(fù)雜化以及優(yōu)勢株系的變化。
[0004] 近年來，基于RNAi (RNA interference)原理的抗病毒育種受到了廣泛的關(guān)注，因 為由dsRNA(double-stranded RNA)誘導(dǎo)的降解同源RNA而造成的基因沉默現(xiàn)象廣泛地存 在于生物體中，將任何目的基因序列插入RNA干擾載體，可獲得沉默靶標(biāo)基因的效應(yīng)。而 且，引發(fā)RNAi的片段并不需要完整的基因序列，還可以是多個病毒的不同基因片段的嵌合 體，因此，RNAi針對的靶標(biāo)基因也可以是多個不同病毒的基因片段。為此，我們將收集到的 ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行多序列比對，從中分 別選取5條和10條長度大于21bp且100%同源的序列區(qū)段，采用人工合成的方式串聯(lián)在一 起，作為RNAi (RNA interference)干擾片段，構(gòu)建反向重復(fù)序列，得到一個RNAi載體。通 過基因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得具有沉默病毒基因表達(dá)效果的轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0005] 專利號為ZL20071009226. 8的發(fā)明專利"利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品 種的方法"，介紹了一種利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)Pi基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P :基因材料的培育 以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用人工合成序列MV1培育抗花葉病甘蔗品種的方法。 針對現(xiàn)有蔗區(qū)甘蔗花葉病嚴(yán)重的問題，人工合成可同時沉默甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒 的新型核酸序列，構(gòu)建RNAi載體，通過基因槍轟擊法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得對花葉病高抗的 轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 本發(fā)明的利用人工合成MV1序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV1序列的 人工合成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在 于：
[0009] ⑴MV1序列的人工合成：
[0010] 從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區(qū)段串聯(lián)在一起，獲得MV1序列，同時在正義 鏈5'端加入Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點(diǎn)，采用 人工合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：
[0011]
【主權(quán)項】
1. 一種利用人工合成MVl序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MVl序列的人工合 成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于： (1) MVl序列的人工合成： 從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區(qū)段串聯(lián)在一起，獲得MVl序列，同時在正義鏈 5'端加入Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點(diǎn)，采用人工 合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下： GATCTAGACT CGAGGACCCA AAAATTGTGG ATTTGCCACA GCATGTTATG CATTATCAGT ATGGAAAAAA GTTACGTCGA TCTCTTAAAC CAAGCATGGG GCGTAGATTT AGGCGCAATG TACAATATCT CAGCTACGCA TCAAATATCA AATTTAGTGC AGAAAAGTCG AGATATTTCA ACCAAACTCC ACCACAGTTT ATGTAAGAGA TAACAATAAG ATCAACAAGA GGATTACTCC TATAGCAACA CCAGATGGAT CCGTCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA ATGCCAAGAT ACGGACTTCA GCGAAACTTG AGGCCCACAT GCAGATGAAA GCTGGAAAAT TTTCAGCAAT ATGGCGTGTG TTCATCTTTA ACCGTGAGAA AAAGCGTAGA TTTAGGCGCT GTTTACAATA TATCAGCTAC GCATCTAATA TCAGATTTAG TGCAGAAGTC AGCTCTACTT TAACCAAACT CCGCAACGGT TTCTACAGGA GAATACAGAG AGACACACAG CTGGCGACGT AGTCGCAACA TGCACTCTCT GTTGGGAGTG CAGCAGCACC ACTAGGGTAC CATCGATAG ； (2) RNAi干擾載體構(gòu)建： (a) 目的片段I的獲得：利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I將目的片段A進(jìn)行酶切，將 酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段I ;所述目的片段I的序列為序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； (b) 目的片段II的獲得：將pHANNIBAL載體質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn) 行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段II，所述目的片段II的序 列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列； (c) 中間載體B的獲得：將回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA連接酶進(jìn)行連 接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，獲得中間載體B ;所述中間 載體B是指將目的片段I插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體； ⑷目的片段III的獲得：提取中間載體B的質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Cla I和Xba I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段III ;所述目的片段III 的序列為序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (e) 目的片段IV的獲得：將目的片段A用限制性內(nèi)切酶Cla I和Xba I進(jìn)行酶切，將酶 切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段IV ;所述目的片段IV的序列為序列表 中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； (f) 中間載體C的獲得：將回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA連接酶進(jìn)行連 接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，獲得中間載體C ;所述中間 載體C是指將目的片段IV插入到中間載體B后獲得的載體； (g) 目的片段V的獲得：提取中間載體C的質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行酶 切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段V ;所述目的片段V的序列為 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； (h) 目的片段VI的獲得：將植物表達(dá)載體pGreenII0229質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段VI ;所述目的片段VI 的序列為序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列； ⑴抗甘蔗花葉RNAi干擾載體pG0229i-MVl的獲得：將回收的目的片段V和目的片段 VI用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證， 獲得可用于遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗受體材料的RNAi干擾載體pG0229i-MVl ; (3)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構(gòu)建完成的RNAi干擾載體 pG0229i-MVl質(zhì)粒DNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，并將其定量至I y g/ y 1，基 因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，分子檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗病 性鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用人工合成MVl序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法， 其特征在于所述從ScMV和SrMV核酸序列中選取若干區(qū)段串聯(lián)在一起，即將收集到的ScMV 各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行多序列比對，從中分別選 取5條和10條長度大于21bp，且100%同源的序列區(qū)段串聯(lián)在一起，共561bp。
【專利摘要】一種利用人工合成MV1序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV1序列的人工合成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育和抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗病性鑒定。本發(fā)明獲得的植物表達(dá)載體采用了RNAi技術(shù)，使得甘蔗抗病毒育種擺脫了對抗源基因的依賴，可以有效地縮短甘蔗抗花葉病育種周期。本發(fā)明已獲得的轉(zhuǎn)基因植株，具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特點(diǎn)。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-113, C12N15-82
【公開號】CN104846006
【申請?zhí)枴緾N201510093082
【發(fā)明人】許莉萍, 郭晉隆, 高世武, 闕友雄, 蘇亞春, 吳期濱, 林慶良
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年3月2日