修飾苯二酚類(lèi)化合物的羥化酶基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種可參與聚酮類(lèi)化合物合成后修飾苯二酚類(lèi)化合物的羥化酶基因， 以及該基因在組合生物合成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 苯二酚類(lèi)聚酮化合物是由細(xì)菌、真菌或植物產(chǎn)生的一大類(lèi)天然產(chǎn)物，有復(fù)雜多變 的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，可開(kāi)發(fā)為藥物。其中二羥基苯甲酸內(nèi)酯和二羥基苯乙酸內(nèi)酯等苯 二酚類(lèi)化合物具有重要藥用活性。
[0003] 在苯二酚類(lèi)聚酮化合物合成過(guò)程中，聚酮合酶將聚酮鏈環(huán)化并釋放后所形成的化 合物的核心骨架結(jié)構(gòu)，可能需要修飾酶的修飾，才能使其具有生物活性或者使其某些性質(zhì) 逐步最優(yōu)化。
[0004] 發(fā)現(xiàn)可修飾合成苯二酚類(lèi)聚酮化合物的酶，以得到更多有新穎結(jié)構(gòu)的聚酮類(lèi)化合 物，是目前得到新型真菌苯二酚類(lèi)聚酮類(lèi)化合物的一種重要手段。
[0005] 雖然現(xiàn)有技術(shù)中已有利用某些羥化酶催化進(jìn)行芳烴類(lèi)的羥化，比如，羥化酶在聚 酮化合物的合成過(guò)程中對(duì)中間產(chǎn)物的芳烴結(jié)構(gòu)進(jìn)行羥基化的修飾。但有關(guān)苯二酚羥化酶基 因的發(fā)現(xiàn)以及利用其修飾聚酮化合物，在聚酮類(lèi)化合物中引入羥基化修飾的的研宄還未見(jiàn) 報(bào)道。發(fā)現(xiàn)新的與苯二酚類(lèi)化合物合成后修飾相關(guān)的酶類(lèi)具有重要的意義。
[0006] 天然產(chǎn)物日規(guī)殼霉素（化合物1)為一種真菌苯二酚類(lèi)聚酮化合物，對(duì)一些常見(jiàn)的 致病菌有較為明顯的抑制作用。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有從日規(guī)殼菌屬類(lèi)真菌中獲得過(guò)苯二酚羥化酶基因。利用苯二酚羥 化酶在日規(guī)殼霉素苯環(huán)上添加羥基可提高其生物活性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的是從日規(guī)殼菌屬類(lèi)真菌中獲得的苯二酚羥化酶基因，獲得有別于天 然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的新型苯二酚內(nèi)酯類(lèi)化合物。
[0009] 本發(fā)明從發(fā)現(xiàn)的一株日規(guī)殼菌屬類(lèi)真菌（Gnomonia)的基因組分析中得到了日規(guī) 殼霉素的合成基因。將日規(guī)殼霉素的合成基因在酵母菌中進(jìn)行異源表達(dá)，從發(fā)酵產(chǎn)物中分 離純化得到了日規(guī)殼霉素。在分析日規(guī)殼霉素的合成基因的基因簇時(shí)，在比對(duì)過(guò)程中發(fā)現(xiàn) 了其附近的一個(gè)預(yù)測(cè)基因?yàn)橐粋€(gè)未知的羥化酶基因，命名為苯二酚羥化酶基因 gnoSal，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明構(gòu)建了可在酵母BJ5464中表達(dá)的含有生物合成日規(guī)殼霉素和羥基化苯二 酚相關(guān)基因的重組質(zhì)粒，并在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，從發(fā)酵產(chǎn)物中提取到不同于原產(chǎn)物日 規(guī)殼霉素結(jié)構(gòu)的聚酮類(lèi)化合物。
[0011] 具體如下：
[0012] 1、獲得 gnoSal 基因
[0013] 通過(guò)基因組挖掘和基因人工合成，獲得合成日規(guī)殼霉素核心骨架（化合物1)的 還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶的編碼基因 gnoSl和gnoS2,以及苯二酚羥化酶基因 gnoSal〇
[0014] 2、聚酮合酶酵母表達(dá)載體構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化
[0015] 將含有完整的gnoSal的DNA片段連接到PRS425載體上，構(gòu)建了組成型表達(dá) 質(zhì)粒PRS425-gnomSAL。將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含還原型聚酮合酶基因 gnomSl的表達(dá)載體 pBDL6061_gnomSl、含非還原型聚酮合酶基因 gnomS2的表達(dá)載體pBDL6062_gnomS2和 PRS425-gnomSal共同轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母受體BJ5464進(jìn)行異源表達(dá)中。
[0016] 3、重組子的篩選
[0017] 化合物1由還原型聚酮合酶GnomSl、非還原型聚酮合酶GnomS2協(xié)作生物合成。在 表達(dá)載體pBDL6061-gnomSl和pBDL6062-gnomS2同時(shí)存在的基礎(chǔ)上再將含苯二酚羥化酶基 因 gnoSal的表達(dá)載體PRS425-gnomSAL同時(shí)轉(zhuǎn)入不能合成亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶缺失的 酵母菌中，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選重組子。
[0018] 4、代謝產(chǎn)物提取與HPLC液相分析
[0019] 重組菌株培養(yǎng)發(fā)酵后用有機(jī)溶劑提取發(fā)酵產(chǎn)物并進(jìn)行HPLC液相分析，分析產(chǎn)物 結(jié)構(gòu)。
[0020] 發(fā)現(xiàn)除了天然產(chǎn)物化合物1 (日規(guī)殼霉素 cytosproneA)的峰外還得到了另外一個(gè) 峰。分離產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析證明得到了與天然產(chǎn)物化合物1不同結(jié)構(gòu)的聚酮類(lèi)化 合物2,經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)化合物2是在原產(chǎn)物化合物1的6位碳原子上加入了羥基。證明了 苯二酚羥化酶基因可用于對(duì)日規(guī)殼霉素及其類(lèi)似物的聚酮化合物的結(jié)構(gòu)修飾，很適合對(duì)各 種活性化合物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾，增加聚酮化合物庫(kù)的多樣性。重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖 及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。圖中化合物1是日規(guī)殼霉素天然產(chǎn)物。
[00?11
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種修飾苯二酚類(lèi)化合物的羥化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的基因在修飾苯二酚類(lèi)化合物中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述修飾，是在苯二酚的苯環(huán)C-6上引入羥基。
4. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述修飾是將如下苯二酚化合物1的C-6羥基化為化合物 2 ：
5. -種苯二酚類(lèi)化合物的羥基化方法，其特征是應(yīng)用了核苷酸序列如SEQ ID N0:1所 示的羥化酶基因。
6. 含權(quán)利要求1所述基因的重組質(zhì)粒。
7. 含權(quán)利要求1所述基因的載體。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一個(gè)從一株日規(guī)殼菌屬類(lèi)真菌(Gnomonia)中發(fā)現(xiàn)的苯二酚羥化酶GnomSal，可作用于真菌聚酮類(lèi)化合物引入羥基化的修飾，獲得有別于苯二酚類(lèi)聚酮化合物天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的新型聚酮類(lèi)物質(zhì)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-81, C12N15-53, C12P7-42
【公開(kāi)號(hào)】CN104862323
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510296767
【發(fā)明人】徐玉泉, 謝李楠, 張維, 張禮文, 郭倩楠
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日