一種地衣芽孢桿菌深層液體發(fā)酵制備耐熱阿魏酸酯酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地衣芽孢桿菌深層液體發(fā)酵制備 耐熱阿魏酸酯酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A)是普遍存在于植物中的一種天然抗氧化劑，是多種植 物中的一種酚酸，具有鎮(zhèn)靜、抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂等獨(dú)特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交聯(lián)的形式存在，人和動物不能直接吸收這類阿魏酸， 必須依靠微生物產(chǎn)生酯酶將阿魏酸游離出來。另一方面，在植物細(xì)胞壁中，阿魏酸或二聚體 阿魏酸主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上，增強(qiáng)阿拉伯木聚糖鏈的 強(qiáng)度，但從空間上限制了動物和微生物對植物細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解。
[0003] 阿魏酸醋酶（EC 3. I. 1. 73，feruloyl esterase)又稱肉桂酸醋酶或肉桂酰醋酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯鍵，將阿魏酸釋放出來。它能與其他水解酶如木聚糖 酶、纖維素酶和木質(zhì)素酶相互聯(lián)合作用，較為徹底地降解細(xì)胞壁中的多糖和木質(zhì)素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、醫(yī)藥、造紙、飼料加工、生物合成及能源開發(fā)等諸多領(lǐng)域都有著巨大的 應(yīng)用潛能。
[0004] 自首次在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶以來，至今已分離純化近30種阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少數(shù)是來自于細(xì)菌，例如嗜酸乳桿菌、枯草芽胞桿菌等，而且 它們的阿魏酸酯酶的酶學(xué)特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生長、酶產(chǎn)量以 及真菌對生長條件的種種限制都制約著酶法制備阿魏酸的工業(yè)化生產(chǎn)。故尋求以細(xì)菌為發(fā) 酵菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，通過菌株活 化、種子液培養(yǎng)、三角瓶發(fā)酵、酶制劑制備的工藝步驟制備耐熱阿魏酸酯酶制劑，所得到的 阿魏酸酯酶耐熱性好、PH適用范圍寬、酶活產(chǎn)量高。
[0006] 所述的地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014年1月2日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC (地址為：中國北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，郵編100101)，保藏編號：CGMCC No. 8672。
[0007] 所述深層液體發(fā)酵制備耐熱阿魏酸酯酶的方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟1，一級種子的制備：首先將液體種子培養(yǎng)基在三角瓶中裝液30mL-50mL，調(diào) 節(jié)pH至7. 0,經(jīng)121°C滅菌20min，冷卻后，按照體積比為4-6v/v%的接種量接種菌株，于 40-45°C的搖床上培養(yǎng)18-24h，得到一級種子液；
[0009] 步驟2,二級種子的制備：按照6-10v/v %的接種量將培養(yǎng)好的一級種子液接種到 二級種子培養(yǎng)基中，32-37°C培養(yǎng)18-24h，得到二級種子液；
[0010] 步驟3,自動發(fā)酵罐發(fā)酵工藝：將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，121°C下滅菌25min， 將步驟2所得二級種子液倒入罐體，開始發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐罐壓0. 05Mpa，發(fā)酵開始到發(fā) 酵24h，發(fā)酵溫度控制在40-45°C，通氣量為3L/mm，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH7. 0。發(fā)酵24-48h，發(fā)酵溫度提高到45-50°C，通氣量增加到4L/mm，攪拌轉(zhuǎn)速維持150r/ min，發(fā)酵48h時(shí)，向發(fā)酵液中添加發(fā)酵促進(jìn)劑15mL，發(fā)酵至60h時(shí)，向發(fā)酵液中添加營養(yǎng)液 200mL，發(fā)酵48h-72h，發(fā)酵溫度降為35-40°C，通風(fēng)量降至3L/mm，發(fā)酵至72h，發(fā)酵罐放出一 半體積發(fā)酵液，然后添加補(bǔ)料培養(yǎng)基和發(fā)酵促進(jìn)劑，35-40°C條件下繼續(xù)發(fā)酵36h后終止發(fā) 酵；
[0011] 步驟4,酶制劑的制備：將步驟3所得發(fā)酵液在4°C、8000r/min、離心20min，所得 上清進(jìn)行超濾濃縮，向濃縮后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，攪拌，再添加8-12wt% 麥芽糊精，攪拌均勻后噴霧干燥，即得阿魏酸酯酶制劑。
[0012] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟1中一級種子培養(yǎng)基配方為：牛肉膏0. 4g、蛋白 胨 0· 8g、酵母粉 lg、NaCl 0· 5g、KH2P04 0· lg、MgS04 ·7Η20 0· 04、蒸餾水 100mL、pH7. 0,121°C 滅菌20min。
[0013] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2中二級種子培養(yǎng)基配方為：豆餅粉lg，玉米粉 2g，葡萄糖 2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸銨 0· 2g，MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml， pH 7· 0-7. 4,121°C 滅菌 20min。
[0014] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：豆餅粉10g，玉米粉 20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡 敵 O.OOlg，定容至 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH7.0-7.5，121°C滅菌 15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/ L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0015] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為：大豆秸桿粉10g、麩皮 粉20g、玉米皮粉10g、豆腐澄20g，定容至1000mL，121°C滅菌15min。
[0016] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中發(fā)酵促進(jìn)劑配方為：Tween 8010g，阿魏酸 乙醋0. 8g，去離子水100mL，121°C滅菌15min。
[0017] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中營養(yǎng)液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆(zhòng) 100mL、胡蘿卜衆(zhòng) 500mL、土?浸出液 500mL，121°C滅菌 15min。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)在于：第一，本發(fā)明的發(fā)酵方法不僅發(fā)酵液后 續(xù)處理簡便、生產(chǎn)成本低廉，而且發(fā)酵獲得的地衣芽孢桿菌活力在218U/mL以上，與國內(nèi)外 其他發(fā)酵罐規(guī)模的阿魏酸酯酶生產(chǎn)方法相比，阿魏酸酯酶總產(chǎn)量和酶活力都達(dá)到了較高的 水平，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景；第二，本發(fā)明得到固體阿魏酸酯酶酶制劑穩(wěn)定性好、適 用范圍廣，酶制劑在37°C溫度下，保存100d，酶活保存在80%以上，阿魏酸酯酶適合在高 溫下酶解，在35°C~65°C之間降解酶活較高，相對酶活都在80%以上，酶的最適pH范圍在 5. 0-8. 0之間，酶活都在90%以上；第三，本發(fā)明所采用的液體發(fā)酵工藝簡單，環(huán)保無毒，原 材料使用豆餅粉、玉米粉、大豆秸桿分、麩皮粉等農(nóng)副產(chǎn)物，成本低廉，整個(gè)發(fā)酵過程可控， 不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)；第四，本發(fā)明的阿魏酸酯酶 固體酶制劑制備工藝簡單，酶活高，酶活力可達(dá)378U/g，總回收率達(dá)到了 81. 5%。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例3中溫度對阿魏酸酯酶固體酶制劑儲藏穩(wěn)定性的影響；
[0020] 圖2為實(shí)施例3中室溫條件下濕度對阿魏酸酯酶固體酶制劑儲藏穩(wěn)定性的影響；
[0021] 圖3為實(shí)施例3中溫度對阿魏酸酯酶固體酶制劑酶解活性的影響；
[0022] 圖4為實(shí)施例3中pH對阿魏酸酯酶固體酶制劑酶解活性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 地衣芽孢桿菌DBM12的篩選方法，包括以下步驟：
[0025] 步驟1，土樣采集及處理
[0026] 土樣采自江蘇省徐州市云龍區(qū)農(nóng)村正處于高溫發(fā)酵中的家畜糞便堆肥。采集的土 樣置密封的無菌塑料袋中于室溫保存，并在1周內(nèi)進(jìn)行目的菌株的分離。
[0027] 取5-10g 土樣放入裝有20_40mL無菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上， 120-160r/min旋轉(zhuǎn)震蕩20-30min，然后將三角瓶置于70-80°C水浴加熱15-30min，期間每 隔5min中震蕩一次。
[0028] 步驟2,富集培養(yǎng)
[0029] 取l_2mL熱處理后的土樣于裝有30-50mL富集培養(yǎng)基一的三角瓶中，在160-180r/ min轉(zhuǎn)速50-60°C下震蕩培養(yǎng)20-24h。然后取l-2mL培養(yǎng)液接種到裝有50mL濃度5-10% 的富集培養(yǎng)基二中，繼續(xù)在160_180r/min轉(zhuǎn)速50-60°C下震蕩培養(yǎng)18-20h。
[0030] 富集培養(yǎng)基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去離子水100mL，調(diào)節(jié)pH4. 0。
[0031] 富集培養(yǎng)基二：NH4N03 (λ 5g，尿素 (λ lg，KH2PO4 (λ lg，NaCl (λ lg，阿魏酸乙酯 lg， 去離子水100mL，調(diào)節(jié)pH3. 0。
[0032] 微量元素：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去離子水 1000mL。
[0033] 步驟3,初篩
[0034] 對第二次富集的培養(yǎng)液無