一株對(duì)除草劑阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株對(duì)除草劑阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿特拉津（2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3,5-三嗪，Atrazine)是一種農(nóng)田 中廣泛使用的三嗪類(lèi)除草劑，主要用于玉米、高粱、甘蔗田闊葉雜草和禾草的防除（Johnson TA，EllsworthTR，HudsonRJM，etal. 2013.)。阿特拉津在全球范圍內(nèi)的使用已經(jīng)超過(guò)50 多年，截止到目前阿特拉津仍是應(yīng)用最廣泛的農(nóng)業(yè)除草劑之一（AckermanF. 2007.)。由于 其半衰期長(zhǎng)、迀移率高，已造成多個(gè)國(guó)家的土壤、地表水和地下水污染（李紅梅，張新建， 李紀(jì)順，等.2014.)，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)飲用水源造成威脅（陳建軍，何月秋，祖艷 群，等.2010.;FreitasLG，SingerH，MUllerSR，etal.2008.)。研宄表明，長(zhǎng)期接觸 低劑量的阿特拉津具有干擾人體內(nèi)分泌激素的活性，目前已被作為環(huán)境科爾蒙可疑物質(zhì) 受到各國(guó)政府的監(jiān)控（SafeS. 2005.;BianchiCL，PirolaC，RagainiV，etal. 2006.) 〇 針對(duì)于阿特拉津污染問(wèn)題，生物降解的方法具有成本低、效率高、不產(chǎn)生二次污染等物理 法和化學(xué)法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)（H，Asakura，MatsutoT. 2009.;董春香，姜桂蘭.2001.; CheynsK，Martin_LaurentF，BruD，etal. 2012.)。阿特拉津的生物降解途徑包括三個(gè) 過(guò)程：水解、脫烷基。開(kāi)環(huán)，目前研宄最深入的兩株阿特拉津降解菌分別為Pseudomonas sp.ADP(SouzaMLD，SadowskyMJ，WackettLP，etal. 1999.)和Arthrobacter aurescensTCI(KS，NS，LPW，etal. 2004.)。本研宄從黑龍江省伊春市南岔區(qū)長(zhǎng)期施用 阿特拉津的玉米田土壤中分離馴化出對(duì)除草劑阿特拉津高效降解的希瓦氏菌，對(duì)希瓦氏菌 對(duì)阿特拉津降解效果進(jìn)行測(cè)定，以期對(duì)以后阿特拉津的生物治理工作提供理論基礎(chǔ)。
[0003] 目前，已有多種阿特拉津降解菌株被國(guó)內(nèi)外研宄人員從不同土壤中篩選出，如： Pseudomonassp.ADP(BehkiRM,KhanSU. 1986.) >Arthrobactersp.AD26(QL,YL,X Z，etal. 2008.)、Bacillussp.HB-6(JinhuaWang,LushengZhu，QiWang,etal. 2014.)、 Pseudaminobactersp.(ET，HZ，SMN，etal. 2000.)、Rhodococcussp.(BehkiR. 1993.)、 Klebsiellsp.Al和Comamonassp.A2(CY.2010.)等，且其中大多數(shù)菌株能夠利用阿特拉 津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)。但是，這些降解菌都受到氮抑制（王志剛，張穎，郭火生等.2014.) 作用，在含有其他氮源的情況下，對(duì)阿特拉津的降解效果影響巨大。
[0004] 如何尋找到一株在含有其他氮源的情況下對(duì)阿特拉津具有明顯降解效果的阿特 拉津降解菌成為急需解決的一大難題？所以，發(fā)明一株對(duì)除草劑阿特拉津具有良好降解效 果的希瓦氏菌，尋找到一種對(duì)除草劑阿特拉津高效降解的希瓦氏菌是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服目前發(fā)現(xiàn)的降解菌利用阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)則降解菌都受到氮抑 制作用，在含有其他氮源的情況下，特別是對(duì)阿特拉津的降解效果影響巨大的難題，本發(fā) 明提供了一個(gè)一株對(duì)除草劑阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌（保藏編號(hào)：CGMCC No.10859)〇
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -株對(duì)除草劑阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌（保藏編號(hào)：CGMCC No. 10859)，具體構(gòu)建及驗(yàn)證過(guò)程如下：
[0008] 本實(shí)驗(yàn)所用的土樣采集自黑龍江省伊春市南岔區(qū)長(zhǎng)期施用阿特拉津的玉米田表 層土（0-15厘米）。將土壤樣品過(guò)20目篩以去除石塊和植物碎肩，然后裝入封口袋中4°C 保存。
[0009] 試劑：阿特拉津原藥（2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3, 5-三嗪）（純度 彡98%)和氰尿酸（2,4,6_三羥基_1，3,5_三嗪）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（純度 多98% )。其他常規(guī)試劑均為分析純或更高純度，用于液相色譜的試劑均為色譜級(jí)。
[0010] 培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母粉5g，用蒸餾水定容到1L，pH 7.0。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM) :KH2P040.9g，Na2HP04*12H20 6.5g，MgS04.7H20 0.2g，NaCl0.4g， 葡萄糖3g作為唯一碳源，微量元素溶液lml(微量元素溶液（g/L) :Na2B407 ? 10H20 0. 4， Na2Mo04 ? 2H20 0? 5,CuS04 ? 5H20 0? 8,FeS04 ? 7H20 2g，MnS04 ?H20 2g，ZnS04 ? 7H20 10g，EDTA 5g)，按照實(shí)驗(yàn)需要加入適量的阿特拉津或氰尿酸。配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%的瓊脂粉。 滅菌條件：120°C高壓滅菌20分鐘。
[0011] 降解菌的富集、馴化與分離：稱(chēng)取5g土樣加入到100mL以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏?源的MSM液體培養(yǎng)基中，阿特拉津初始濃度為50mg/L，置于搖床中，30°C，150r/min振蕩 培養(yǎng)7天。7天之后將培養(yǎng)液以10%接種到新的以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏吹腗SM液體培 養(yǎng)基中，同時(shí)將阿特拉津濃度提升至100mg/mL，以此類(lèi)推不斷升高阿特拉津濃度。8次 富集培養(yǎng)之后，將菌液分半稀釋1〇_3、1〇_ 4、1〇_5，劃線培養(yǎng)于含有阿特拉津的1511固體培 養(yǎng)基中，5天之后挑取顏色、形態(tài)不相同的菌落進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)2個(gè)多月的馴化，觀察到 500mg/L阿特拉津的錐形瓶中白色沉淀大部分已經(jīng)消失，且培養(yǎng)液趨于澄清。將阿特拉 津濃度為500mg/L的培養(yǎng)液采用稀釋平板涂布法將培養(yǎng)液涂布在阿特拉津MSM固體平 板上，挑取顏色、形態(tài)各不相同的菌落進(jìn)行純化，并結(jié)合常規(guī)鏡檢方法進(jìn)行分析，最終得 到Y(jié)JY4菌株。降解菌株的鑒定：⑴生理生化鑒定：將待測(cè)菌株接種于LB固體平板上， 參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（趙斌，何紹江? 2002.)和《Bergey'sManualofSystematic Bacteriology(secondedition)》（GeorgeMG,JuliaAB,TimothyGL. 2004.)進(jìn)行鑒定。 (2)16SrDNA鑒定：由于同一種、屬間細(xì)菌的16SrDNA序列直接具有高度的保守性，所以 16SrDNA序列的同源性分析通常被用作細(xì)菌之間的系統(tǒng)分類(lèi)。以各個(gè)菌株的總DNA為模 板，采用PCR技術(shù)對(duì)降解群落中的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增，擴(kuò)增引物采取通用 引物：27-F(5' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3,)和 1492-R(5' -TACCTTGTTACGACTT-3'） (劉春光，楊峰山，盧星忠等? 2010.)。PCR反應(yīng)條件為：94°C5min;94°Clmin，52°Clmin， 72°C2min，30個(gè)循環(huán)；72°C10min，反應(yīng)體系為25yL。擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)試劑盒（美國(guó)Axygen 公司）回收，之后與PMD19-T載體（日本TaKaRa公司）連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a中，送 到蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，得到的結(jié)果通過(guò)Genbank進(jìn)行同源性比對(duì)，從而確定到其分 類(lèi)地位。通過(guò)16SrDNA分析，YJY4被鑒定為Shewanellasp. 〇
[0012] 菌株YJY4降解效果測(cè)定：⑴阿特拉津的測(cè)定：將培養(yǎng)液與三氯甲烷1:2比例混 合，在搖床中充分震蕩lOmin，隨后離心（8000rpm)6min，用移液器吸取下層液體放入圓底 燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將液體蒸干，之后用色譜級(jí)甲醇溶解殘留物，過(guò)0. 22ym有機(jī)相微孔 濾膜，裝入進(jìn)樣瓶中。檢測(cè)條件（王靜，李迎芳，裴麗娟等.2013.):流動(dòng)相甲醇：水= 60:40 (V:V);柱溫30°C;流速0. 8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)225nm;進(jìn)樣量10yL。⑵氰尿酸的測(cè)定： 將培養(yǎng)液離心，吸取上清液，過(guò)0.22ym無(wú)機(jī)相微孔濾膜，裝入進(jìn)樣瓶中。檢測(cè)條件（Zhang Y,JiangZ,CaoB,etal. 2011.):流動(dòng)相 0? 005mol/L磷酸氫二鉀和 0? 002mol/L磷酸二氫 鉀混合液：甲醇=95:5(V:V);柱溫35°C;流速lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)200nm;進(jìn)樣量20yL。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明一株對(duì)除草劑阿特