一種新型黃瓜snp分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型黃瓜SNP分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜白粉病是一種廣泛發(fā)生的世界性病害，是黃瓜主要葉部病害之一。其潛育期 短、流行性強(qiáng)、周年發(fā)生，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量與品質(zhì)。目前，黃瓜白粉病的主要防治措施是化 學(xué)防治，但產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量是不可忽視的安全問題，特別是利用設(shè)施栽培后，黃瓜生產(chǎn)的連 作障礙問題越來越嚴(yán)重。因此，選育抗病品種仍是從根本上防治白粉病的有效途徑。
[0003] 分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)使人們對(duì)于基因的準(zhǔn)確檢測(cè)、目標(biāo)基因的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移成為現(xiàn) 實(shí)。研究者們利用AFLP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)抗病基因進(jìn)行了初步的定位，但抗病基因 與分子標(biāo)記的遺傳距離普遍較遠(yuǎn)，說明黃瓜白粉病抗性分子機(jī)理非常復(fù)雜，更多科學(xué)問題 有待于研究和探索，充分挖掘和利用該些抗性基因，將豐富黃瓜白粉病抗性育種中的抗性 基因資源，并為黃瓜白粉病抗性育種中導(dǎo)入優(yōu)良抗性基因提供重要基礎(chǔ)。
[0004]SLAF-seq(^specificlengthamplifiedfra卵entsequencing)技術(shù)是由高通量 測(cè)序技術(shù)發(fā)展而來。通過生物信息學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案系統(tǒng)設(shè)計(jì)，構(gòu)建SLAF-seq文庫(kù)，篩選特 異長(zhǎng)度DNA片段，W高通量測(cè)序技術(shù)獲得海量序列，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析比對(duì)，獲得大量 特異DNA片段，進(jìn)而依據(jù)其序列發(fā)展出特異分子標(biāo)記。SLAF-seq技術(shù)具有通量高、準(zhǔn)確性 高、成本低、周期短等突出優(yōu)勢(shì)，依其測(cè)序結(jié)果可直接開發(fā)大量特異分子標(biāo)記。該技術(shù)可用 于單體型圖譜、遺傳圖譜、關(guān)聯(lián)性圖譜、多態(tài)性圖譜的構(gòu)建，為分子育種、系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)資 源鑒定提供重要技術(shù)保障。本發(fā)明利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)了一批特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的黃 瓜白粉病抗性特異分子標(biāo)記，為育種中導(dǎo)入抗性優(yōu)良基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇提供重要 基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型黃瓜SNP分子標(biāo)記，為探索黃瓜白粉病 抗病機(jī)理和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了理論依據(jù)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] -種新型黃瓜SNP分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的標(biāo)號(hào)為SLAF7695,其核巧酸序列為

[0009] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0010] 有助于黃瓜白粉病抗性基因定位，為黃瓜白粉病抗性育種中的分子標(biāo)記輔助選擇 提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例新型黃瓜SNP分子標(biāo)記的核巧酸序列表。
[0012]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中SLAF標(biāo)簽在染色體上的分布圖。
[0013] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中第1染色體上深度分布圖。
[0014]圖4為本發(fā)明實(shí)施例中多態(tài)性標(biāo)記在各染色體上的分布圖。
[0015] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例中差異標(biāo)記在各染色體上的分布圖。
[0016]圖6為本發(fā)明實(shí)施例中第1染色體上差異比值整體分布圖。
[0017] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例中第1染色體差異標(biāo)記遺傳圖。
【具體實(shí)施方式】
[001引為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中分子標(biāo)記的核巧酸序列表，其中兩對(duì)引物分別是：
[0020] F； 5'ATGGAGACGACATTGGAAACG3' 580
[0021] R； 5'ATGGAAAAGTGAGTCCGTGA3' 1367
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例中W抗病材料BK2為父本、感病材料H136為母本，根據(jù)其接種白粉 病后的抗/感表現(xiàn)，利用BSA法在前期構(gòu)建的F2群體中，挑取50個(gè)抗白粉病和感白粉病的 家系組成抗/感白粉病池。材料均種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡試驗(yàn)基地。將親本BK2、 化36及F2群體株系在可調(diào)控溫度、濕度的智能溫室內(nèi)盆栽。于黃瓜幼苗一葉一屯、期，采用 噴霧接種法，接種濃度為1X104-1X1〇6個(gè)抱子/ml。接種后每S天觀察、記錄一次發(fā)病情 況，共記錄15天。然后根據(jù)抗/感白粉病的表現(xiàn)型結(jié)果，挑取高抗和高感的家系各50個(gè)組 成抗/感白粉病池。
[002引實(shí)施例
[0024] 取兩葉一屯、期的材料嫩葉，采用改良的SDS法提取其基因組DM,稀釋至60ng/ y心經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)濃度。利用酶切預(yù)測(cè)軟件SLAF_Predict系統(tǒng)分析黃瓜基因組， 根據(jù)其GC含量、重復(fù)序列和基因特點(diǎn)等確定酶切方案、切膠范圍及測(cè)序量，W保證分子標(biāo) 記的密度和均勻性。
[00巧]分別取基因組DNA各500ng，加0.抓Mse I(肥B，Hitchin，Hei~ts，UK)、T4DNA連 接酶（肥B)、ATP(肥B)和Mse I接頭（肥B)在37°C下反應(yīng)15h，65°C退火比，然后加限制性 內(nèi)切酶Hae III和Bfa I在37°C下反應(yīng)化。反應(yīng)結(jié)束后用如ick Spin column(Qiagen) 純化酶切產(chǎn)物，并用33yL邸回溶。W回收的酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體 系25yL，包括模板DNA 100ng、10Xbuffer 2. 5yL、2. 5mmol/L、dNTP 2yL、5U/yL的 Taq DM合成酶（肥B)0. 3yL、10ymol/L Msel引物2yL、d地20加至25yL。PCR產(chǎn)物經(jīng) E. Z. N.A.切cle Pure Kit(Omega)純化后，加入Mse I、T4 DM連接酶、ATP及Solexa接頭， 37°C下反應(yīng)化。利用Quick Spin Column Qiagen)純化產(chǎn)物，2%瓊脂糖膠電泳。利用Gel Extraction Kit (Qiagen)回收瓊脂糖膠中230-250bp的條帶，并W其為模板，在含化usion Master Mix(肥B)和Solexa引物混合物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用Illumina GAIIx(mumina，San Diego, CA，USA)測(cè)序。
[0026] 每個(gè)樣品的測(cè)序有效數(shù)據(jù)量需達(dá)到50, 000個(gè)W上，測(cè)序深度5XW上。利用軟件 SLAF_Poly.pi.對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行識(shí)別和低質(zhì)量過濾，得到有效原始DNA序列數(shù)據(jù)，再利用比 對(duì)軟件BLAT將各樣品有效數(shù)據(jù)分別進(jìn)行相似度聚類，并通過深度識(shí)別，糾正測(cè)序錯(cuò)誤，得 到各樣品有效序列。
[0027] 參考基因組為黃瓜參考基因組，基因組組裝為染色體，基因組經(jīng)酶切處理打斷為 多個(gè)小片段，每個(gè)片段相當(dāng)于一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，同一位點(diǎn)reads序列通過相似性聚類，形成一 個(gè)group;group中高深度片段即為潛在基因型，低深度片段可能是測(cè)序錯(cuò)誤，通過糾錯(cuò)策 略對(duì)低深度片段進(jìn)行糾正，最終獲得具有1個(gè)或多個(gè)等位基因的SLAF標(biāo)簽。根據(jù)SLAF標(biāo) 簽的基因組定位結(jié)果，統(tǒng)計(jì)SLAF標(biāo)簽在各染色體上的數(shù)量，繪制SLAF標(biāo)簽在染色體上的分 布圖。
[002引對(duì)得到的SLAF標(biāo)簽，根據(jù)等位基因數(shù)和基因序列之間的差異進(jìn)行多態(tài)性分析，獲 得多態(tài)性標(biāo)記的類型和數(shù)量，對(duì)獲得的多態(tài)性標(biāo)記根據(jù)定位結(jié)果，統(tǒng)計(jì)其在各染色體上的 分布情況。
[0029] 對(duì)獲得的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行親本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)親本測(cè)序深度確定等位基因的親 本來源，選取一種基因型來源于P(H136)，另一種基因型來源于M炬K2)的多態(tài)性標(biāo)記。分別 計(jì)算兩個(gè)群體aa、油（感池、抗池）中來源于不同基因型的差異比值（Ratio),根據(jù)Ratio_ aa> = 1與Ratio_ab> = 3篩選差異標(biāo)記，獲得差異標(biāo)記及其在染色體上的數(shù)量分布。
[0030] 差異比值計(jì)算方法如下：
[0031]Maa表示aa群體來源于M的深度；Paa表示aa群體來源于P的深度；Mab表示油 體來源于M的深度；Pab表示ab群體來源于P的深度；
[0032]Ratio_aa=化a/Maa;當(dāng)Maa= 0 時(shí)Ratio_aa= 1000 ;Ratio_ab=Mab/P油；當(dāng) P油=0 時(shí)Ratio_ab= 1000。
[0033] 結(jié)果與分析
[0034] 采用SLAF-seq技術(shù)，獲得父本服2、母本化36及抗/感白粉病池的原始序列。經(jīng) 測(cè)序共獲得各樣品的有效reads為16, 977, 114條，4個(gè)樣品的Reads數(shù)分別達(dá)3, 293, 311、 4, 517, 307、5, 073, 477和4, 093, 019,達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。Reads長(zhǎng)度、數(shù)量和GC含量的統(tǒng)計(jì)結(jié) 果見表1。
[0035] 表1樣品數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)
[0036]
[0037]表中；Sample;樣品編號(hào)；BMK-ID;樣品；Readlength;使用的read長(zhǎng)度；Read number;各樣品的reads數(shù)；GCpercentage;GC含量。
[0038] 測(cè)序得到的有效SLAF片段，其DM序列經(jīng)與黃瓜基因組序列進(jìn)行比對(duì)，獲得有效 的SLAF標(biāo)簽數(shù)量為73, 100個(gè)，整體平均深度為99. 1IX。
[0039] 根據(jù)SLAF標(biāo)簽的基因組定位結(jié)果，SLAF標(biāo)簽在各染色體上的數(shù)量分別為11