一種黑霉菌生產(chǎn)(s)-溴苯乙醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到黑霉菌細胞生物催化制備手性醫(yī)藥中 間體（S)-3' -溴苯乙醇的技術。
【背景技術】
[0002] 手性（S)-3' _溴苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品和其他特殊材料的 重要中間體。生物催化不對稱反應具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點，作為綠色高 效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化合物。生 物催化制備手性（S)-3' -溴苯乙醇具有很好的應用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%，原子 經(jīng)濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現(xiàn)體內輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)_3'_溴苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品的重要手性砌塊，。現(xiàn)有 的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷，難于進行 工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備（S)_3' -溴苯乙醇。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明采用黑霉菌細胞催化制備（S)-3'_溴苯乙醇，反應式如下：
3'-溴苯乙酮（1)經(jīng)黑霉菌催化反應，得到產(chǎn)物（S)_3'_溴苯乙醇（2)。有多種微生 物可以催化此反應，經(jīng)過大量實驗篩選，最終確定采用黑霉菌作為催化劑，因為其催化反應 的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多黑霉菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實驗，本 發(fā)明選用黑霉菌菌株為ATCC MYA-1177，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實驗確定的輔助底物為：葡萄糖20-23g/L、麥芽糖40-48g/L、 異丙醇5-6%V/V (體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質： 1、 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/ L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制 固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，黃豆粉3-5g/L，酵母浸 膏 6-9g/L，葡萄糖 18-22 g/L，麥芽浸膏 25-30 g，硫酸銨 0? 5-0. 7g/L，硫酸鎂 0? 3-0. 4g/L， 磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L，碳酸鈣0. 7 g/L，硫酸亞鐵0. 18 g/L，硫酸錳0. 025 g/L;pH 6. 3 2、 固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0012] 黑霉菌細胞制備。黑霉菌經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng) 液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將黑霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為 10-11%，通氣比為0.9-1￥/(￥分鐘），24-25°(：培養(yǎng)35-40小時，用過濾式離心機離心得到 濕黑霉菌細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0013] 生物催化轉化。底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入底 物3'-溴苯乙酮，使底物濃度為80-90 g/L。其他成份：玉米漿（以干物質計）含量為 19-20g/L，吐溫 80 17-18g/L，葡萄糖 20-23g/L、麥芽糖 40-48g/L、異丙醇 5-6%V/V(體積濃 度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至24-25°C時，加入濕黑霉菌細胞使其濃度為77-80g/L， 通氣比為0. 12-0. 13VAV分鐘)，進行生物催化反應，反應時間為70-72小時；反應結束后， 濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)_3'_溴苯乙醇，反應轉化 率98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對映體過量率98. 5-99 %。
[0014] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優(yōu)化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0015] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0016]培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，黃豆粉3-5g/L，酵母浸 膏 6-9g/L，葡萄糖 18-22 g/L，麥芽浸膏 25-30 g，硫酸銨 0? 5-0. 7g/L，硫酸鎂 0? 3-0. 4g/L， 磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L，碳酸鈣0. 7 g/L，硫酸亞鐵0. 18 g/L，硫酸錳0. 025 g/L;pH 6. 3 濕黑霉菌細胞制備過程如下：黑霉菌ATCC MYA-1177經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種子液。 1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將黑 霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為10-11%，通氣比為0. 9-1V/ (V分鐘)， 24-25°C培養(yǎng)35-40小時，用過濾式離心機離心得到濕黑霉菌細胞，用作生物催化反應催化 劑。
[0017] 生物催化轉化：0.5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入 底物3'-溴苯乙酮，使其濃度為80g/L，玉米漿（以干物質計）含量為19g/L，吐溫80 18g/ L，葡萄糖20g/L、麥芽糖48g/L、異丙醇5%V/V (體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至 24°C時，加入濕黑霉菌細胞使其濃度為77g/L，通氣比為0. 12V/ (V分鐘），進行生物催化反 應，反應時間為72小時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得 到產(chǎn)物（S)-3'-溴苯乙醇，反應轉化率99%，產(chǎn)品收率97%，對映體過量率98. 5%。
[0018] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0019]培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質