一種提高產(chǎn)那西肽的活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高產(chǎn)那西肽的活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法，特別涉及利用 低能離子束提高活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法，屬于物理誘變技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 那西肽（Nosih印tide)含豐富的硫元素，屬多肽類抗生素，主要由活躍鏈霉菌產(chǎn) 生；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有良好的抑制作用，通過與23SRNA和核糖體蛋白L11組成的復(fù)合體緊 密結(jié)合，從而抑制延長(zhǎng)因子活性和GTP的水解，最終抑制了蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)菌的生長(zhǎng)受 到抑制。那西肽由于其在腸道中溶解度低，不容易被動(dòng)物吸收，因而可以在腸道內(nèi)保持較高 的藥物濃度，它具有用量低、抑菌范圍廣、動(dòng)物體內(nèi)不殘留等特點(diǎn)，可明顯促進(jìn)雞、豬、魚等 動(dòng)物的生長(zhǎng)，因此是一種理想的新型非吸收性動(dòng)物飼料添加劑。
[0003] 目前，許多國(guó)家和地區(qū)都在使用那西肽。國(guó)內(nèi)的多家企業(yè)和科研院所對(duì)那西肽的 菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化方面做了大量工作，但發(fā)酵水平較低，作為水平提高關(guān)鍵因素的 菌種仍有很大的提升空間。
[0004] 近年來離子束生物技術(shù)在微生物誘變育種的應(yīng)用越來越廣泛，低能離子注入作為 一種新的誘變?cè)闯晒欠浅ｏ@著的，低能離子是指能量在10 4KeV-105KeV之間的離子，它是 相對(duì)于傳統(tǒng)輻射生物學(xué)中106KeV-109KeV而言的，能夠引起靶物質(zhì)原子移位和重排，使細(xì)胞 表面產(chǎn)生刻蝕和穿孔，并能影響和改變細(xì)胞電性等現(xiàn)象，從而使菌體產(chǎn)生突變。
[0005] 利用低能離子注入技術(shù)誘變時(shí)的主要技術(shù)難點(diǎn)是低能離子的能量低，理論射程很 短，活躍鏈霉菌未經(jīng)受過低能離子處理，低能離子對(duì)活躍鏈霉菌作用效果受哪些因素影響， 目前并未研究清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法，該 方法可以有效提高活躍鏈霉菌誘變幾率低的問題，為后續(xù)篩選高產(chǎn)那西肽的突變活躍鏈霉 菌提供技術(shù)支持。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種提高活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法，步驟如下：
[0009] (1)取活躍鏈霉菌孢子至無菌水中，混合均勻，制得活躍鏈霉菌單孢子懸液；
[0010] ⑵將步驟（1)制得的活躍鏈霉菌單孢子懸液稀釋至10~20cfu/mL，然后涂布 至含篩選因子的平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行低能離子束的梯度劑量的注射誘變，靶室真空度為 6. 0~8. 0X10 3Pa，注射脈沖劑量設(shè)定為80~100X2. 6X1013ionsAcm2 ?s)，注射完成后， 進(jìn)行后續(xù)篩選培養(yǎng)。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中鏈霉菌孢子為生長(zhǎng)均勻、豐滿的活躍鏈霉菌 的孢子。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，篩選因子選自那西肽、卡那霉素。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，篩選培養(yǎng)條件為：28~30°C、濕度20~60% 的條件下，培養(yǎng)7~8天。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，所述篩選因子的質(zhì)量百分比濃度為0. 005~ 0? 02%〇
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，含篩選因子的平板培養(yǎng)基組分如下，均為質(zhì) 量百分比：
[0016] 可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氫鉀0. 04~0. 06%、硫酸 亞鐵0. 001 %、硝酸鉀0. 08~0. 12 %、硫酸鎂0. 04~0. 06 %、氯化鈉0. 04~0. 06 %、篩選 因子0? 005~0? 02%、輕質(zhì)碳酸鈣0? 4~0? 6%、瓊脂1. 5~2. 0%，余量水，pH6. 5~7. 0。 上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121°C滅菌30min。
[0017] 有益效果
[0018] 1、本發(fā)明采用低能離子束作為誘變方式，具有損傷輕、突變率高、突變普廣的特 點(diǎn)，其與傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變作用機(jī)理不同，低能離子束通過引起氨基酸和小分子無機(jī)化 合物的損傷導(dǎo)致電荷和基團(tuán)變化等引起突變；同時(shí)發(fā)明人通過對(duì)活躍鏈霉菌研究，發(fā)現(xiàn)提 高誘變的條件，能夠大大提高活躍鏈霉菌的突變效果。
[0019] 2、本發(fā)明所述提高活躍鏈霉菌突變幾率的誘變方法，采用低能離子束進(jìn)行誘變， 同時(shí)輔助用以那西肽和卡那霉素的抗性篩選，操作簡(jiǎn)便，效率高、篩選效果好，解除了菌種 對(duì)常規(guī)物理和化學(xué)誘變的疲勞效應(yīng)。
[0020] 3、本發(fā)明通過對(duì)活躍鏈霉菌孢子懸液稀釋后涂布含0. 01 %篩選因子的平板培養(yǎng) 基，再進(jìn)行低能離子束脈沖注入，通過計(jì)算致死率確定最佳注入劑量，確定最佳注射劑量后 對(duì)活躍鏈霉菌孢子懸液進(jìn)行了誘變，初篩、復(fù)篩和連續(xù)傳代試驗(yàn)，利用本申請(qǐng)所述的方法， 可以極大提高活躍鏈霉菌的突變幾率，為篩選出高性能菌株奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0021] 圖1是實(shí)施例1的活躍鏈霉菌低能離子束的梯度劑量的注射誘變致死率曲線；
[0022] 圖2是對(duì)比例3的活躍鏈霉菌紫外線誘變致死率曲線；
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限 于此。實(shí)施例中所使用的設(shè)備均按照現(xiàn)有技術(shù)。
[0024] 配制培養(yǎng)基：
[0025] 培養(yǎng)基組分如下，均為質(zhì)量百分比：
[0026] 平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氫鉀0. 04~ 0. 06%、硫酸亞鐵0. 001 %、硝酸鉀0. 08~0. 12%、硫酸鎂0. 04~0. 06%、氯化鈉0. 04~ 0. 06%、輕質(zhì)碳酸鈣0. 4~0. 6%、瓊脂1. 5~2. 0%，pH6. 5~7. 0。上述培養(yǎng)基可采用常 規(guī)配制方法，采用純化水配制、121°C滅菌30min。
[0027] 斜面培養(yǎng)基配比：可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氫鉀 0. 04~0. 06%、硫酸亞鐵0. 001 %、硝酸鉀0. 08~0. 12%、硫酸鎂0. 04~0. 06%、氯化鈉 0? 04~0? 06%、輕質(zhì)碳酸鈣0? 4~0? 6%、瓊脂1. 5~2. 0%，pH6. 5~7. 0。上述培養(yǎng)基可 采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121°C滅菌30min。
[0028] 種子培養(yǎng)基配比：蔗糖1.5~2.0%、蛋白胨0.8~1.2%、硫酸銨0. 1~0.3%、 輕質(zhì)碳酸?丐〇. 3~0. 5%，純化水配制、pH6. 5~7. 0、121°C滅菌30min。
[0029]發(fā)酵培養(yǎng)基配比：熱榨豆餅粉3. 0~3. 5%、玉米淀粉6. 0~8. 0%、硫酸鈉0. 1~ 0? 3%、磷酸二氫鉀0? 01~0? 03%、硫酸銨0? 1~0? 3%、輕質(zhì)碳酸鈣0? 2~0? 3%、豆油 0? 5~0? 7%，自來水配制、pH自然、121°C滅菌30min。
[0030] 菌種：活躍鏈霉菌NX-9,購(gòu)自中科院微生物所；那西肽純品購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所， 卡那霉素純品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。
[0031] 實(shí)施例1:
[0032] 孢子懸液制備：
[0033] 取活躍鏈霉菌NX-9生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜 面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上 震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得活躍鏈霉菌單孢子懸液；
[0034]稀釋：
[0035] 將活躍鏈霉菌單孢子懸液依次稀釋為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7,分別 取0.lmL涂布平板培養(yǎng)基，放置在溫度28~30°C、濕度20-60%的條件下培養(yǎng)7~8天，計(jì) 算平板內(nèi)的菌落數(shù)，平板內(nèi)菌落數(shù)100~200個(gè)為宜，梯度10 3和10 4符合標(biāo)準(zhǔn)；
[0036] 誘變劑量的確定：
[0037] 將活躍鏈霉菌孢子懸液稀釋至10 3,分別取孢子懸液0.lmL涂布在含有質(zhì) 量百分比為0.01 %那西肽的平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行低能離子束的梯度劑量的注射誘變， 革巴室真空度為8. 0X10 3Pa，注射脈沖劑量設(shè)定為nX2. 6X1013i〇ns/ (cm2 ?s)，n= (30, 50, 70, 90, 110, 130)，選取六個(gè)梯度進(jìn)行注射，注射完成后，平板放置于溫度28~ 30°C、濕度20~60%的條件下培養(yǎng)7~8天，通過計(jì)算平板菌落數(shù)，在90X2. 6X1013i〇ns/ (cm2 ?s)的劑量下致死率達(dá)到90%，結(jié)果如圖1所示。
[0038]誘變：
[0039] 將活躍鏈霉菌孢子懸液稀釋至10 3,取孢子懸液0.lmL涂布在含有質(zhì)量百分比為 0. 01 %那西肽的平板培養(yǎng)基上，在90X2. 6X1013i〇nV(cm2 ?S)的脈沖劑量下進(jìn)行照射，照 射完成后平板放置于溫度28~30°C、濕度20~60%的條件下培養(yǎng)7~8天，挑選單菌落 60個(gè)，接入500ml發(fā)酵瓶，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。
[0040]初篩：
[0041] 單菌落接入發(fā)酵瓶后，在溫度28~30°C、濕度20~60%的條件下培養(yǎng)210~ 240h，搖床轉(zhuǎn)速220~240rpm，然后測(cè)定效價(jià)，效價(jià)提高幅度明顯的單菌落有9個(gè)；單菌落 傳斜面后在溫度28~30°C、濕度20~60%的條件下培養(yǎng)7~8天，以效價(jià)高的9個(gè)單菌 落的斜面作為復(fù)篩的出發(fā)菌株，進(jìn)行復(fù)篩。初篩結(jié)果如表1所示：<