一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量pcr檢測的特異性引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組用于口腔中幽門螺桿菌的實 時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 1983年，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡稱Hp)被澳大利亞的Warren和 Warshail發(fā)現(xiàn)，引起了大量學者的關(guān)注。Krajden于1989年首次從胃炎患者牙菌斑中分 離培養(yǎng)出Hp，幽門螺桿菌感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴瘤有著密切 的聯(lián)系。大量學者研究發(fā)現(xiàn)患有消化性疾病患者口腔Hp與其胃粘膜內(nèi)的形態(tài)學和生物學 特征相似，具有同源性。
[0003]以前大量的研究都集中在胃部的幽門螺桿菌。但是唾液、口腔潰瘍、舌背、口腔腫 瘤中也存在大量的Hp，口腔是Hp胃外重要的儲存場所，口腔有可能是胃內(nèi)Hp感染和復(fù)發(fā)的 來源。因此研究口腔中Hp的感染情況具有重要的臨床意義。Song等認為，Hp作為條件致 病菌，可存在于健康人和消化道疾病患者的口腔內(nèi)，當環(huán)境改變時會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。同時 我們可以推測，如果口腔內(nèi)Hp可以根除、口腔健康可以很好改善，胃內(nèi)Hp感染可能更容 易預(yù)防、徹底根除。
[0004]流行病學調(diào)查顯示，Hp感染在世界各地均較為常見，具有很高的發(fā)病率，因此迫切 需要一種快速、特異的檢測方法。目前診斷Hp感染的方法很多，包括尿素酶檢測、細菌培 養(yǎng)、組織學染色、血清Hp抗體檢測等，而針對口腔Hp的診斷檢測方法并不多。Hp可產(chǎn)生大 量的尿素酶，利用尿素酶試驗可檢測口腔內(nèi)Hp，口腔內(nèi)有多種細菌尿素酶陽性，如唾液鏈球 菌等，容易產(chǎn)生假陽性，特異性低，因此此種方法的應(yīng)用難以讓人信服。細菌的分離培養(yǎng)是 檢測Hp的金標準，且可進行藥敏試驗，指導(dǎo)臨床用藥，但是口腔內(nèi)Hp的數(shù)量較少且口腔菌 群復(fù)雜，微生物種類多，檢測敏感性低，陽性檢出率低。PCR技術(shù)作為一種分子生物學工具， 可以選擇性體外擴增DNA或RNA片段，特異性強、敏感性高，用于牙菌斑、唾液Hp的檢測，不 受菌量少、是否為活菌的因素影響，已廣泛應(yīng)用于臨床和科研。近年來發(fā)展起來的實時熒光 定量PCR(Fluorescence quantitativePCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性檢測邁上量化的臺階， 實現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污染的問題，它相對 于常規(guī)PCR技術(shù)先進、操作簡便，實現(xiàn)了實時監(jiān)測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有 靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于設(shè)計一組用于定量測定口腔中幽門螺桿菌含量的特異性引物和 探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于幽門螺桿菌檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定量PCR 檢測的方法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將幽門螺桿菌16S核糖體RNA基因（16srRNA)片 段插入到載體PMD18-T中，獲得含有16srRNA基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標準品。根 據(jù)幽門螺桿菌16s rRNA的基因片段編碼基因序列設(shè)計并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化 PCR反應(yīng)條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進 行評估。
[0006] 本發(fā)明提供一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物 和探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1)_(3)中的一種： (1) 、上游引物：5'_ TGGCGCACGGGTGAGT-3' ； 下游引物：5' -CCAATGGCTATCCCAAACTAAGA-3'； 探針：5' - ACGCATAGGTCATGTGC-3' ； 所述引物和探針擴增的目標核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2; (2) 、與（1)所述序列互補的序列； (3) 、將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一至數(shù)個堿基得 到的序列。
[0007] 經(jīng)實驗驗證，將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一 至數(shù)個堿基得到的序列也能很好的擴增上述目標核苷酸序列。
[0008] 優(yōu)選地，所述探針的5'端熒光報告基團是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3'端標記的 是熒光淬滅基團TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0009] 本發(fā)明還提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包 括權(quán)利要求1所述的引物和探針。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針、試劑盒在定量檢測口腔中幽 門螺桿菌含量中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第四個目的是提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，步 驟如下： (1)制備標準品：將幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段插入到載體pMD18-T中，獲得含 有幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標準品；所述幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段參見序列表中SEQ ID No. 1的第6-353位核苷酸序列； (2 )標準曲線繪制； (3) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標準品采用相同的反應(yīng)體 系進行實時熒光PCR擴增； (4) 通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行干酪乳桿菌的快速定量檢測。
[0012] 優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌16S rRNA保守基因片段是通過以下引物擴增得到的： 上游引物為 5'- TGGCGGCGTGCCTAATACA-3' ； 下游引物為 5' - GTTGCTGCTTCAGGGITT-3'。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（3)中所述引物和探針的用量均為1.6 iil。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（3)中所述實時熒光PCR擴增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2分鐘， 94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。
[0015] 本發(fā)明提供用于對幽門螺桿菌進行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢 測樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，也可以通過提取幽門螺桿菌的基因組DNA，結(jié)合實時熒光 定量PCR檢測技術(shù)，可達到準確定量待測標本中幽門螺桿菌含量的目的。本發(fā)明所提供的 引物和探針可對口腔中的幽門螺桿菌含量進行定性、定量分析，對判斷口腔中幽門螺桿菌 活性菌的含量以至于后續(xù)研究胃內(nèi)Hp感染具有重要意義，本發(fā)明將在微生物臨床檢測領(lǐng) 域發(fā)揮重要作用。應(yīng)用本發(fā)明的引物和探針能夠快速、準確、靈敏、特異性好的定量檢測待 測標本中幽門螺桿菌的含量。
【附圖說明】
[0016] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。下面結(jié)合附圖以及具體實施方案對 本發(fā)明做更詳細闡述。在附圖中： 圖1為引物和探針體系優(yōu)化實驗結(jié)果；其中，a代表引物為1. 6 y 1，探針為1. 6 y 1 ;b 代表引物為l.〇y 1，探針為1.6y 1 ;c代表引物為l.Oy 1，探針為0. 8y 1 ;d代表引物為 2. 0 y 1，探針為0. 8 y 1 ;e代表引物為1. 6 y 1，探針為0. 8 y 1 ;f代表引物為2. 0 y 1，探針為 1. 〇 y 1 ;g代表引物為1. 〇 y 1，探針為〇. 8 y 1 ;h代表引物為1. 0 y 1，探針為1. 0 y 1 ;i代表 引物為2. 0 y 1，探針為1. 6 y 1 ; 圖2為靈敏度實驗結(jié)果；其中，a代表質(zhì)粒濃度分別為1. 00X 108coPies/ml、b代表 質(zhì)粒濃度為l.〇〇X107copies/ml、c代表質(zhì)粒濃度為1.00X 106copies/ml、d代表質(zhì)粒濃 度為1.00X 105COpies/ml、e代表質(zhì)粒濃度為1.00X 104COpies/ml、f代表質(zhì)粒濃度為 1. 00X 103copies/ml、g代表質(zhì)粒濃度為1. 00X 102copies/ml和陰性對照； 圖3為特異性實驗結(jié)果；其中出現(xiàn)標準擴增曲線的為幽門螺桿菌質(zhì)粒，未出現(xiàn)標準擴 增曲線的大腸埃希菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡 萄球菌、糞腸球菌、乙型溶血性鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌、腦膜炎 奈瑟菌、陰性對照； 圖4為幽門螺桿菌標準曲線。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工 程(上海）股份有限公司合成和完成。
[0018] 實施例1 16s rRNA基因標準品的制備 要建立實時熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應(yīng)包含 高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。16S rRNA基因廣泛存在于原核生物中， 具有很高的保守性。本發(fā)明采用幽門螺桿菌16S rRNA基因作為靶序列。本實施例主要 采用PCR技術(shù)擴增幽門螺桿菌的16S rRNA基因，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體 PMD18-T中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMD18-T-HP16S，并進行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定 量作為待建立方法的標準品，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。
[0019] -、模板DNA的制備 提取幽門螺桿菌(標準菌株）基因組DNA，用作16S rRNA基因PCR擴增的模板： (1) 取lml菌懸液，8000r/min離心5分鐘，棄上清液； (2) 加入10%蔗糖的TE緩沖液400 y 1懸浮菌液沉淀，混勻后加入20mg/ml的溶菌酶 20 y 1，37°C作用 45min ; (3) 加入30yl 10%SDS和 3yl lOmg/ml 蛋白酶 K，55°C 水浴 lh; (4) 加入500 y 1的酸/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)混勾，12000r/min離心10min ; (5) 取上清，加入500 y 1的氯仿/異戊醇(體積比24:1)混勾，12000r/min離心10min ; (6) 取上清，加入50 y 1 3M NaAc和800 y 1的無水乙醇，-20°C靜置30min，離心去上 清； (7) 沉淀用70%的乙醇洗滌，干燥； (8) 溶于50 y 1雙蒸水中，-20°C保存。
[0020] 二、16S rRNA基因片段的PCR擴增 1、引物的設(shè)計與合成 本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中幽門螺桿菌16S rRNA基因全序列進行生物信息學比對分 析，選取適合設(shè)計引物和探針的保守片段序列(序列表SEQ ID No. 1中第6-353位核苷酸序 列）為革G目標，應(yīng)用P