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一種制備恩拉霉素對照品的方法

文檔序號:9365770閱讀:831來源:國知局
一種制備恩拉霉素對照品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥工程領(lǐng)域,具體涉及一種制備恩拉霉素對照品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分離出來的放線菌Streptomycesfungicid1us N0.B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十幾種氨基酸結(jié)合成的多肽類抗生素。其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu),脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端,據(jù)其末端脂肪酸種類不同,分為恩拉霉素A(Ciq7H138CI2N26O31)和恩拉霉素B (CiqsH14qCI2N26O31)。恩拉霉素則是主要由這兩種成分組成的混合物(結(jié)構(gòu)見圖1)。該藥于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā),1974年在日本正式注冊,其后在許多國家被注冊和廣泛使用。其中,該藥于1993年在我國成功注冊,用于藥物飼料添加劑。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用,長期使用后不易產(chǎn)生抗藥性,而且恩拉霉素內(nèi)服極不易被吸收,藥物主要通過糞便排出體外,殘留畜禽體內(nèi)較少。除此之外,它還能改變腸道內(nèi)的細菌群落分布,有利于飼料營養(yǎng)成份的消化吸收,促進動物增重和提高飼料利用率,因此被世界上許多國家推薦作為抗生素促生長劑,是一種不錯的飼料添加劑。
[0003]
[0004]目前,市場上使用的恩拉霉素都是恩拉霉素預(yù)混劑,其中恩拉霉素都未經(jīng)過純化。如專利ZL201010198230.5和CN201210120843.6公開的方法,其都是直接通過含有恩拉霉素的發(fā)酵液直接進行預(yù)混劑的制備。隨著生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展,科研工作者正在不斷的對恩拉霉素的產(chǎn)品質(zhì)量進行提高。如專利CN201210433028.5公開了一種恩拉霉素粗品的制備方法,其產(chǎn)品純度可達到70%左右;CN201210153458.1公開了一種通過大孔吸附樹脂純化得到90%以上純度恩拉霉素的方法;專利ZL201010213986.2涉及一種利用大孔弱酸性陽離子交換樹脂分離提取恩拉霉素的方法,該方法可以使得恩拉霉素的純度達到95%以上;專利ZL201110344875.X涉及一種從恩拉霉素發(fā)酵液種提取、分離和純化恩拉霉素的方法,該方法的流程為將恩拉霉素發(fā)酵液進過熱處理后,過濾,離心,收集菌體;向菌體加入甲醇溶液后,超聲,過濾;濾液先酸化后堿化,然后脫色,脫色液過大孔吸附樹脂進行吸附,用甲醇洗脫,收集洗脫液,經(jīng)濃縮結(jié)晶后,冷凍干燥得到恩拉霉素,該方法得到的恩拉霉素的純度達到95%左右;CN201310730536.4公開了一種通過弱酸性和弱堿性大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法純化得到99%以上的恩拉霉素的方法。除此之外,ZL201210433029.X涉及一種反相層析制備高純度恩拉霉素A和B的方法,ZL201210159394.6涉及一種高壓液相制備恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品的方法。
[0005]恩拉霉素對照品除了對純度有要求,其對恩拉霉素A和B的比例也有一定的要求,其最佳比例在1:1.1-1.8。就目前已有的技術(shù)來看,較高純度的恩拉霉素的制備方法雖然有很多,但是并沒有文獻公開恩拉霉素A和B在最佳比例范圍的高純度的恩拉霉素對照品的制備方法。本發(fā)明提供的方法不僅能夠很好地純化恩拉霉素,使恩拉霉素的純度達到95.0%以上,而且恩拉霉素A和B的比例不需要通過額外控制就能達到最佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種制備高純度的恩拉霉素對照品的方法。
[0007]本發(fā)明涉及一種制備恩拉霉素對照品的方法,所述方法包括:
[0008](I)提供恩拉霉素在pH值為6.0-7.5,醇的體積百分含量為30_40%的醇-水混合溶劑中的溶液;
[0009](2)將步驟⑴所述溶液連續(xù)上樣至裝填了非極性大孔吸附樹脂的樹脂柱中,直到流出液中恩拉霉素A:恩拉霉素B = I:2-2.5,停止上樣;
[0010](3)用pH值為2.0-4.0,醇的體積百分比為40% -80%的醇-水溶液洗脫步驟(2)所得樹脂柱,得到含有恩拉霉素對照品的洗脫液;
[0011](4)從步驟(3)所得洗脫液中分離得到恩拉霉素對照品。
[0012]其中,步驟(I)所述的pH值為6.5-7.0。
[0013]其中,步驟(I)所述溶液中醇的體積百分含量為35%,所述醇優(yōu)選為甲醇或乙醇。
[0014]其中,步驟⑴所述恩拉霉素中恩拉霉素A:恩拉霉素B= 1:1.5-4,優(yōu)選為1:2-3。
[0015]其中,步驟(2)所述非極性大孔吸附樹脂選自H60,HB60,H41或HP20ss,優(yōu)選H60。
[0016]其中,步驟(3)所述的醇-水溶液中醇的體積百分含量為40-70%,所述的醇優(yōu)選為甲醇或乙醇。
[0017]其中,步驟(3)所述的pH值為3.00
[0018]其中,步驟(4)所述恩拉霉素對照品中恩拉霉素A:恩拉霉素B = 1:1.1?1.8。
[0019]可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)從步驟(3)所得洗脫液中分離得到恩拉霉素對照品,包括但不限于溶劑蒸發(fā)法,結(jié)晶等等。
[0020]在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中,步驟⑷包括以下步驟:
[0021](i)收集并合并HPLC純度在90%以上的含有恩拉霉素對照品的洗脫液;
[0022](ii)將步驟⑴所得洗脫液濃縮至干,得到恩拉霉素對照品。
[0023]在另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中,步驟(4)包括以下步驟:
[0024](i)收集并合并HPLC純度在90%以上的含有恩拉霉素對照品的洗脫液;
[0025](ii)超濾步驟(i)所得洗脫液;
[0026](iii)將步驟(ii)所得濾液pH值調(diào)至2.0-4.0,加入活性炭脫色并過濾;
[0027](iv)納濾步驟(iii)所得溶液;
[0028](V)將步驟(iv)所得濾液pH值調(diào)至6.0-8.0,得到恩拉霉素對照品的沉淀物;
[0029](vi)分離并干燥步驟(V)所得恩拉霉素對照品的沉淀物。
[0030]其中,步驟(ii)所述超濾的截留分子量范圍為5000-20000D,優(yōu)選10000D ?’步驟(iv)所述納濾的截留分子量范圍為200-1000D,優(yōu)選200-500D。
[0031]如無特別說明,本發(fā)明所述的恩拉霉素A與恩拉霉素B的比值指的是恩拉霉素A與恩拉霉素B的HPLC色譜含量比。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0033]本發(fā)明所述方法制備得到的恩拉霉素對照品純度可以達到95.0%以上,而且所得對照品中恩拉霉素A和B的比值不需要通過額外控制就能達到1:1.1-1.8的最佳比值范圍,操作非常簡單方便,另外本發(fā)明的方法收率高,非常適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
圖1恩拉霉素A和B的結(jié)構(gòu)式
【具體實施方式】
[0034]以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明。必須指出,這些實施例是用于說明本發(fā)明,而不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0035]以下實施例中所述的恩拉霉素發(fā)酵液可以采用本領(lǐng)域常用的產(chǎn)恩拉霉素的菌株進行發(fā)酵后得到。比如通過發(fā)酵殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)得到含有恩拉霉素的發(fā)酵液。(Higashide E, Hatano K, Shibata M, Nakazawa K.Enduracidin, anew antib1tic.1.Streptomyces fungicidicus N0.B5477, an enduracidin producingorganism.J Antib1t (Tokyo).1968, 21 (2):126-37.)
[0036]以下實施例選用的HPLC分析檢測方法為:
[0037]色譜柱-Agilent HC_C1S4.6 X 250mm,5 μ m ;
[0038]流動相:緩沖液(3.0ml磷酸+500ml /K,用NaOH調(diào)節(jié)pH = 3.8)/甲醇/乙腈=500/300/200(v/v/v);
[0039]檢測波長:232nm;
[0040]流速:1.0m
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