肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物人工肝支持系統(tǒng)（BALSS)是以具有一定功能的肝細(xì)胞為依托的，能夠在一定 程度上對(duì)人體發(fā)揮類(lèi)似于肝臟功能的裝置，一方面可以為可逆性肝功能損害患者提供短期 的支持，順利過(guò)渡至肝功能恢復(fù)，另一方面可以對(duì)不可逆性肝功能衰竭患者在等候肝移植 期間給予支持，起到肝功能衰竭及肝移植之間的橋梁作用。肝細(xì)胞是BALSS的核心部分，因 此體外培養(yǎng)肝細(xì)胞并使其發(fā)揮原有的生理作用，成為了BALSS研究的重點(diǎn)。以往肝細(xì)胞多 使用人或動(dòng)物血清進(jìn)行培養(yǎng)，但由于其具有免疫排斥反應(yīng)和致敏性，易受外源微生物污染 等缺點(diǎn)，并不適應(yīng)于人體應(yīng)用。
[0003] -般細(xì)胞培養(yǎng)需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5-10%動(dòng)物血清，基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有適量的 能量物質(zhì)和微量元素等，而血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的各種生長(zhǎng)因子、激素及蛋白質(zhì)等 成分。目前用于肝細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要包括町111 &111'8￡培養(yǎng)基，01^11，01^11/^12， RPMI-1640，M-199，ML-15等。傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的主要缺點(diǎn)在于1.由于種屬特異性，異種 動(dòng)物血清具有免疫排斥反應(yīng)和致敏性；2.血清內(nèi)容易攜帶朊病毒等，且易受病原微生物污 染；3.不同批次間可能存在差異，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)性；4.血清中某些蛋白成分 可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。
[0004] 無(wú)血清培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)的思路關(guān)鍵在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的生長(zhǎng)因子、激素、 微量元素、促粘附物質(zhì)等，使無(wú)血清培養(yǎng)基的作用接近于含血清培養(yǎng)基。目前已商品化的肝 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基較少，其中具有代表性的是H印atoZYME-SFM。HepatoZYME-SFM是目前肝 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中的代表之一，但不同的肝癌細(xì)胞系，對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)各成分的需求并不相 同，因此不同細(xì)胞系最適宜的培養(yǎng)基配方并不相同，HepatoZYME-SFM不具備廣泛的通用性。
[0005] 絲膠蛋白（sericin)是從蠶絲中提取的蛋白質(zhì)，含大量側(cè)鏈帶親水基團(tuán)的氨基酸 如絲氨酸、天冬氨酸等，分子量為10- 400kDa，易溶于水中，在蠶營(yíng)繭時(shí)起著黏合作用。目 前絲膠蛋白已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)絲膠蛋白對(duì)多種體外 培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖和粘附能力均有明顯的促進(jìn)作用DhNayakS[3]等的研究中，在2%海 藻酸鹽溶液中加入0. 125%的絲膠蛋白，以此溶液將H印G2細(xì)胞按IX106/ml密度重懸，使 用注射栗將細(xì)胞懸液以不同速率擠出不同大小的微珠，將微珠收集于含有0. 2MCaC12溶液 的膠化浴中并靜置15min，然后以0. 5 %殼聚糖溶液對(duì)微珠進(jìn)行包裹30min，最后將微珠浸 入京尼平溶液（2.5mg/ml，37°C，4h)中進(jìn)行交聯(lián)，從而制成微囊。經(jīng)此微囊化培養(yǎng)的細(xì)胞， 細(xì)胞活力及白蛋白、尿素合成功能均明顯優(yōu)于未加絲膠蛋白的對(duì)照組。
[0006] 絲膠蛋白-藻酸鹽-殼聚糖微囊化培養(yǎng)的缺點(diǎn)也非常突出，主要在于制作工序較 復(fù)雜，不利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)，且在包裹過(guò)程中溶液成分、滲透 壓的劇烈變化，容易導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是結(jié)合絲膠蛋白的優(yōu)勢(shì)，提供一種添加了適當(dāng)濃度的絲膠蛋白的適 用于生物人工肝的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0008] 為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -種肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，其包括以下組分：
[0010] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL;
[0011] 絲膠蛋白0. 05~0. 5% ;
[0012] 地塞米松 0? 1 ~lOOOnmol/mL；
[0013] 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子5~20ng/mL;
[0014] 表皮生長(zhǎng)因子10~50ng/mL;
[0015] 青鏈霉素 100U/mL。
[0016] 可選擇地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI-1640、DMEM、MEM、M199、F-10、F-12、DMEM/F-12 l:l、McCoy's5A、William'sE、ML-15中的任意一種。優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM。
[0017] 更優(yōu)地，還包括胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白_亞硒酸鈉合劑。所述胰島素_轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞 硒酸鈉合劑的濃度為1%。
[0018] 更優(yōu)地，還包括亞油酸。所述亞油酸的濃度為llng/mL。
[0019] 優(yōu)選地，還包括羥乙基哌嗪乙硫磺酸。所述羥乙基哌嗪乙硫磺酸的濃度為lOmmol/ L0
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0021] (1)本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，其改進(jìn)了無(wú)血清培養(yǎng)基配方，使其更適合肝細(xì) 胞的生長(zhǎng)及功能發(fā)揮。
[0022] (2)本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)需復(fù)雜的操作，即可對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清培 養(yǎng)。
[0023] (3)本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，可直接用于生物型人工肝。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞活力的影響對(duì)比 結(jié)果圖。
[0025] 圖2為本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中 白蛋白含量的對(duì)比結(jié)果圖。
[0026] 圖3為本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中 尿素含量的對(duì)比結(jié)果圖。
[0027] 圖4為本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中 谷草轉(zhuǎn)氨酶含量的對(duì)比結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0029] 實(shí)施例一
[0030] 本發(fā)明的肝細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的各組分的濃度篩選
[0031] 1.正交優(yōu)化設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基中各組分的濃度：
[0032] 正交試驗(yàn)方案：本研究包括絲膠蛋白（A)，地塞米松（B)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (HGF(C))及表皮生長(zhǎng)因子（EGF(D)) 4個(gè)因素，每個(gè)因素選用3個(gè)水平（見(jiàn)表1)，因此選用 L9 (34)正交表，試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。研究選用DEME高糖型為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入胰島素5yg/ml， 轉(zhuǎn)鐵蛋白5yg/ml，亞硒酸鈉lOyg/L，亞油酸llng/ml，HEPES10mmol/L，青鏈霉素100U/