一種通過降低副產(chǎn)物乙酸高效生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，即：同時敲除克雷伯氏肺炎桿菌中與乙 酸合成相關(guān)的兩個基因，從而提高1，3 -丙二醇發(fā)酵的生產(chǎn)水平。
【背景技術(shù)】 陽00引 1，3 -丙二醇（1，3 -po;rpanediol，簡稱1，3 -PD)是一種重要的化工原料，其最 重要的用途是作為單體合成新型聚醋一一聚對苯二甲酸丙二醇醋（PTT)。研究表明PTT- 種性能特別優(yōu)異的聚醋材料，因而1，3 -PD的工業(yè)價值日益引起各國的重視?，F(xiàn)在的研究 表明：1，3 -PD的生產(chǎn)方法中生物合法法因條件溫和、操作簡單、副產(chǎn)物少、綠色環(huán)保，比化 學(xué)合成法更有工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)勢。特別是隨著生物柴油工業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量廉價的工業(yè) 甘油原料，利用廉價的工業(yè)甘油原料生物合成法生產(chǎn)1，3 -PD成為現(xiàn)今1，3 -PD生產(chǎn)研 究中的一個熱點。
[0003] 自然界中能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3 -PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎桿菌 (Klebsielapneumoniae)、弗氏巧樣菌（Citrobacterfreundii)、下酸梭狀芽抱桿菌 (Clostridiabutyricum)等等。其中克雷伯氏肺炎桿菌因生物轉(zhuǎn)化效率高、生物轉(zhuǎn)化過程 操作方便，研究應(yīng)用最多。但是克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油生產(chǎn)1，3-ro的同時還會產(chǎn)生大 量的副產(chǎn)物，主要有乳酸、2, 3-下二醇和乙酸等，其中副產(chǎn)物乙酸的毒性最強(qiáng)。
[0004] 本發(fā)明公開了一種通過降低克雷伯氏肺炎桿菌的乙酸合成，提高產(chǎn)物1，3-ro生 物合成的方法。該方法通過同時敲除克雷伯氏菌中與乙酸合成關(guān)聯(lián)的兩個基因poxB和 pta，W降低克雷伯氏菌中副產(chǎn)物乙酸的合成，提高產(chǎn)物1，3-ro的產(chǎn)量。poxB基因負(fù)責(zé)編碼 丙酬酸氧化酶，在生物體內(nèi)催化丙酬酸合成乙酸；Pta基因負(fù)責(zé)編碼憐酸轉(zhuǎn)乙酷酶，該酶是 催化乙酷輔酶A合成乙酸中的關(guān)鍵酶，目前有關(guān)運兩個基因在克雷伯氏菌中的具體作用還 沒有詳細(xì)研究，通過同時敲除運兩個基因提高1，3-ro的產(chǎn)量的研究更是沒有報道。經(jīng)過檢 索國家知識產(chǎn)權(quán)局（WWW.Sipo.gov.cn)、世界產(chǎn)權(quán)組織（WWW.Wipo.int)、歐洲專利局Grow. espacenet.com)和美國專利商標(biāo)局（WWW.uspto.gov)也沒有發(fā)現(xiàn)與本專利保護(hù)請求相同 的公開專利或授權(quán)專利。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本申請的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，同時敲除克雷伯氏菌中兩個基因poxB、和Pta可W顯著降至乙酸的合成，并能顯著提高1，3-PD的生物合成。所W，本發(fā)明目的在于提供一 種更高效生產(chǎn)1，3 -PD的方法，即：將克雷伯氏肺炎桿菌中兩個基因poxB和Pta同時敲除， 高效地生產(chǎn)1，3 -PD。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，利用本發(fā)明生產(chǎn)1，3 -PD時，產(chǎn)生更少的副產(chǎn) 物乙酸，極大緩降了后期乙酸積累對發(fā)酵的影響，提高了 1，3-PD的生產(chǎn)速度，同時因更多 的甘油轉(zhuǎn)變?yōu)?，3 -PD也大大提高了 1，3 -PD生物合成的轉(zhuǎn)化率。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：將克雷伯氏菌中的兩個基因poxB和Pta同時 敲除，高效生產(chǎn)1，3 -PD。本發(fā)明包括種子培養(yǎng)W及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1，3 -PD。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明，所述poxB和Pta兩個基因具體如下：
[0008] DpoxB:負(fù)責(zé)編碼丙酬酸氧化酶巧C1. 2. 5. 1)，該酶又稱丙酬酸脫氨酶；
[0009] 2)Pta:負(fù)責(zé)編碼憐酸轉(zhuǎn)乙酷酶巧C2. 3. 1.8)。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，用于轉(zhuǎn)化甘油生成1，3 -PD的菌株為克雷伯氏肺炎桿菌 化.pneumoniae)。相比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3 -PD的方法，本發(fā)明的方法的優(yōu)點是：畐山 產(chǎn)物少，產(chǎn)物合成速度快、轉(zhuǎn)化率高。
【具體實施方式】
[0011] W下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)理解，W下實施例僅用于說 明本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0012] 實例中，斜面培養(yǎng)基的配方如下：
[0013] K2HPO43H2O7g/l，（NH4)2S04Ig/LKH2PO42g/l，MgClzTHzOO. 1g/l，酵母膏 7邑/1，微 量元素各0. 3血，調(diào)整抑7. 0,瓊脂2g/L。
[0014] 種子培養(yǎng)基的配方如下：
[0015] K2HPO43H2O7g/l，（畑4)25〇4Ig/l，KH2PO42g/l，MgCl27H2〇0.Ig/l，酵母膏 7邑/1，微 量元素各0. 3血，調(diào)整抑7.0后加入化Cl調(diào)節(jié)滲透壓。
[0016] 發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方如下：
[0017] KCl0. 75g/l，NaHzPO* 1. 38g/l，（畑4)25〇4 5. 35g/l，Na2S〇40. 28g/l，1拆〇46&0 0. 26g/l，巧樣酸0. 42g/l，酵母粉2g/l，微量元素各0. 3mU調(diào)整pH7. 0。
[0018] 微量元素的配方如下：
[0019] ZnClz：M. 2g/L，2. 7g/L，MnClzAHzOlOg/L，C11CI22H200 . 85g/L，C0CI22H2O 23.8g/l，H3BO30. 31g/l，Na2Mo〇4 0. 25g/L
[0020] 實施例中，測定發(fā)酵液中菌體干重的方法如下：
[OOW 取1. 0血發(fā)酵液稀釋7 - 10倍，W去離子水為對照，在721分光光度計上于620皿 讀取0D。取不同菌濃（即不同620nm吸光值）的菌液IOmU經(jīng)離屯、收集菌體，并用去離子 水洗涂二遍洗涂，將再次離屯、收集后的菌體于8(TC烘箱中干燥至恒重。稱量菌體作出菌體 干重與0成2。的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸出關(guān)系式。W后菌體的干重根據(jù)測定的菌液的OD62。值由 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸關(guān)系式計算得出。發(fā)酵液中1，3 -PD的測定采用氣相色譜法；乙酸的測定 采用液相色譜法。產(chǎn)1，3 -PD的菌株采用克雷伯氏肺炎桿菌CCTCCM2014574,W下簡稱 M2014574。
[0022] 實施例1、單獨敲除poxB基因嚴(yán)重降低菌體生長，不利于1，3 -PD的合成
[0023] 將12014574菌株于18培養(yǎng)基（0.5%酵母提取物，1%膜蛋白腺，1%化(：1，9^.0) 中37°C培養(yǎng)過夜，抽提基因組。W抽提好的M2014574基因組為模板，依據(jù)NCBI登錄的克 雷伯氏肺炎桿菌MGH78578的基因組序列ODCUS:NC_ 009648)上的poxB基因（locus_ tag:KPN_00904)設(shè)計引物，PCR反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測序，測序后對目的條帶進(jìn) 行基因分析，與MGH78578上poxB基因的相似度為100%。用同