一種去除a47l降低痘苗病毒免疫優(yōu)勢(shì)的方法及病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因工程及免疫領(lǐng)域，具體設(shè)及一種去除A4化降低痘苗病毒免 疫優(yōu)勢(shì)的方法及病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] 痘苗病毒是一種大分子DNA病毒，是人類(lèi)消滅天花的主要疫苗，能夠引起強(qiáng)烈的 免疫反應(yīng)和超長(zhǎng)的免疫記憶。由于活痘苗病毒作為疫苗在天花免疫中的成功應(yīng)用，痘苗病 毒被當(dāng)做衡量一個(gè)疫苗有效與否的"金標(biāo)準(zhǔn)"，受到廣泛的重視。
[0003] 現(xiàn)階段世界上多個(gè)W痘苗病毒為載體的，旨在預(yù)防感染性疾病W及腫瘤的重組疫 苗已經(jīng)進(jìn)入臨床測(cè)試階段，但其中的多數(shù)均未能達(dá)到理想的免疫效果。一個(gè)重要的原因就 是，在重組疫苗引發(fā)的免疫應(yīng)答中，針對(duì)載體本身的反應(yīng)牢固地占據(jù)著優(yōu)勢(shì)地位，并顯著地 抑制了外源性目的抗原的免疫原性，即疫苗載體的免疫優(yōu)勢(shì)效應(yīng)。痘苗病毒自身的一些表 位，尤其是一些優(yōu)勢(shì)表位（dominantepitope)如B8R、A4化、K化等的存在，能夠在很大程度 上影響宿主針對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答。在保持痘苗病毒感染和復(fù)制能力的前提下，去除病 毒本身的一些優(yōu)勢(shì)表位，從而降低載體本身對(duì)外源性目的抗原的限制作用，對(duì)于提高重組 疫苗的有效性勢(shì)必具有非常重要的作用。
[0004]A4化是痘苗病毒上的一種重要的〇b限制性的殺傷性T細(xì)胞表位。A4化位于痘苗病 毒基因組的右側(cè)末端，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。A47L 在痘苗病毒感染中高轉(zhuǎn)錄高表達(dá)，但其功能在痘苗病毒生長(zhǎng)和復(fù)制過(guò)程中是非必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為降低作為疫苗載體的痘苗病毒的免疫優(yōu)勢(shì)，提高重組痘苗病毒疫苗的安全 性和有效性，本發(fā)明提供了 一種重組痘苗病毒的方法，W痘苗病毒W(wǎng)esternReserve株 為骨架，在去除A4化基因的同時(shí)插入卵清蛋白（OVA)基因，構(gòu)建表達(dá)OVA的重組病毒 VACV-AA4化-0VA，此為本發(fā)明的目的。去除痘苗病毒的優(yōu)勢(shì)表位A4化對(duì)外源抗原免疫原 性的抑制，可有效降低痘苗病毒自身的免疫優(yōu)勢(shì)，增加外源性抗原（如OVA)的免疫原性。本 發(fā)明生成的A4化基因缺失的重組痘苗病毒（VACV-AA4化)，可為疫苗和基因治療提供更為 有效的載體，此為本發(fā)明的另一目的。
[0006] 本發(fā)明所述的重組痘苗病毒，是將野生痘苗病毒的A4化基因替換為帶有LacZ標(biāo) 記的OVA基因得到的重組痘苗病毒。
[0007] 在本發(fā)明的實(shí)例中，所述野生痘苗病毒為野生型WR株痘苗病毒，所述的野生型WR 株痘苗病毒的基因組DNA序列為GenBank號(hào)為AY243312. 1的序列（V化14-MAR-2006)。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0009] 一種重組痘苗病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0010]S1、構(gòu)建質(zhì)粒pSCllA47k0VA;
[0011]S2、pSCllA47k0VA在CV-1細(xì)胞中與野生型痘苗病毒重組；
[0012] S3、篩選純化獲得重組病毒（VACV- AA4化-OVA)。
[0013] 其中，所述步驟S1的具體步驟如下：
[0014]S11、取凍存的野生型痘苗病毒和本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的VACV-0VA病毒，使用Biomiga病 毒基因組提取試劑盒，提取基因組DNA;
[0015]S12、根據(jù)野生型痘苗病毒的A4化基因及其上下游序列，設(shè)計(jì)引物，W野生型痘苗 病毒基因組DNA為模板，PCR獲得A4化基因的上下游同源序列臂A47化如A4化R。
[0016]S13、將獲得的上下游同源臂A47化和A47LR通過(guò)酶切和連接的方法分別替代 pSCll質(zhì)粒的TKL和TKR，獲得中間質(zhì)粒PSCA47L。
[0017]S14、根據(jù)GenBank中OVA基因序列，設(shè)計(jì)引物，WVACV-0VA病毒基因組DNA為模 板，通過(guò)PCR獲得OVA基因，將獲得的OVA基因插入中間質(zhì)粒PSCA4化的P7. 5啟動(dòng)子之后， 得到痘苗病毒重組工具穿梭質(zhì)粒pSCA47k0VA。
[001引其中，所述步驟S2的具體步驟如下：
[0019] 待培養(yǎng)的〇^-1細(xì)胞至80%單層時(shí)，^0.05101感染野生型痘苗病毒并使用 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pSCllA47k0VA質(zhì)粒至感染細(xì)胞中，48小時(shí)后，收集病毒。
[0020] 其中，所述步驟S3的具體步驟如下：
[0021] 取上述收集的病毒反復(fù)凍融S次，超聲破碎后感染新的CV-1細(xì)胞，并覆蓋瓊脂培 養(yǎng)基；2天后，加入含有300yg/mLX-gal的上層培養(yǎng)基篩選重組病毒。挑取孤立藍(lán)斑病毒， 連續(xù)單斑純化5代。經(jīng)PCR、基因測(cè)序和WesternBlot進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定無(wú)誤后，進(jìn)行重 組病毒的體外增殖，并將最終收獲的病毒采用密度梯度離屯、純化，保存于-80°C。
[0022] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0023] 證實(shí)A4化為痘苗病毒本身具有的與復(fù)制和感染無(wú)關(guān)、但卻顯著抑制外源抗原免 疫性的表位，去除A4化后，在痘苗病毒載體中插入的外源性抗原能夠成功地誘導(dǎo)有效的細(xì) 胞免疫應(yīng)答，并能夠產(chǎn)生免疫記憶，再次感染誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)。本發(fā)明構(gòu)建的 去除A4化基因的重組痘苗病毒，可顯著提高W痘苗病毒為載體的疫苗的有效性，為疫苗研 發(fā)提供良好的方法和載體。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的pSCllA47k0VA質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中穿梭質(zhì)粒目的基因插入的檢測(cè)，其中泳道A為插入質(zhì)粒的 目的條帶OVA(152化P)，泳道B為質(zhì)粒未插入目的基因產(chǎn)生的條帶（347bp)。
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中質(zhì)粒pSCllA47k0VA酶切鑒定示意圖，其中泳道A為基因 錯(cuò)誤連接的酶切結(jié)果，泳道B為目的基因正確連接的酶切結(jié)果，均與使用VectorNTI分析 的酶切結(jié)果（右側(cè)）一致。
[0027] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒的藍(lán)斑篩選。
[002引圖5為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒的密度梯度離屯、純化。
[0029] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒中的A4化基因，WA4化鑒定引物對(duì)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，其中泳道A和B分別為VACV- AA4化和VACV- AA4化-OVA產(chǎn)生的A4化缺失的條帶 巧02bp)，泳道C野生型痘苗病毒產(chǎn)生的A4化條帶（126化P)。
[0030] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒中外源目的基因OVA擴(kuò)增，其中泳道A顯示在野 生型痘苗病毒中無(wú)特異性條帶產(chǎn)生，泳道B為VACV-AA4化-OVA產(chǎn)生的OVA條帶，泳道C為VACV-0VA陽(yáng)性對(duì)照。
[0031] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例中外源性目的蛋白OVA的表達(dá)，其中泳道A和B分別為 VACV-AA4化-OVA和陽(yáng)性對(duì)照VACV-0VA感染細(xì)胞后表達(dá)的OVA蛋白條帶，泳道C顯示野生 型痘苗病毒感染后細(xì)胞中無(wú)OVA蛋白表達(dá)。
[0032] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒在BSC-1細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線。
[0033] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒在CV-1細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線。
[0034] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒誘導(dǎo)的初次細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0035] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例中重組病毒誘導(dǎo)的免疫記憶。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[003引下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[00測(cè)實(shí)施例
[0040] 本實(shí)施例中痘苗病毒W(wǎng)R株在西安醫(yī)學(xué)院分子病毒與病毒免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn) 室，下同）保藏，內(nèi)嵌OVA基因的重組痘苗病毒（VACV-0VA)由申請(qǐng)人構(gòu)建并在本實(shí)驗(yàn)室保 藏，僅去除A4化基因未插入任何片段的重組痘苗病毒（VACV-AA47L)由申請(qǐng)人構(gòu)建并在本 實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pSCll由BernardMoss教授（美國(guó)NIH)惠贈(zèng)，細(xì)胞株CV-1和BSC-1購(gòu) 自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、。所使用的小鼠為雌性6周齡巧7BL/6小鼠，體重18-22g，購(gòu)于 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁育中屯、，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在恒溫恒濕的SPF級(jí)鼠房?jī)?nèi)進(jìn)行。
[0041] 主要試劑和材料：
[0042]DMEM，胎牛血清，脂質(zhì)體（lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Invitrogen公 司，Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶及T4DNA連接酶均購(gòu)自肥B公司，病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自 Biomiga公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。
[0043] 步驟1、質(zhì)粒pSCllA47k0VA的構(gòu)建和鑒定
[0044] 將野生痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列的第152935-153939位（對(duì)應(yīng)序列1的 1-1005位，命名為上游同源左臂A4化L)和154628-155517位（對(duì)應(yīng)序列2的1-890位，命 名為下游同源右臂A4化時(shí)，分別克隆替換pSCl1質(zhì)粒的T化和TKR，進(jìn)而將OVA基因連接到 pSCll質(zhì)粒的啟動(dòng)子P7. 5之后，得到重組質(zhì)粒pSCllA47k0VA。
[0045] 具體操作如下：
[0046] 1. 1野生型痘苗病毒W(wǎng)R株基因組DNA和VACV-0VA病毒基因組DNA提取
[0047] (1)取-80°C凍存的野生型痘苗病毒和VACV-0VA病毒各200y1，4°C解凍。
[0048] (2)加入等體積的PLYbuffer,縱滿(mǎn)混勻，室溫放置15分鐘。
[004引 做加入0