一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的issr標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食用菌DNA標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域，更具體涉及一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雙孢蘑菇是我國(guó)的大宗食用菌之一，2014年全國(guó)雙孢蘑菇總產(chǎn)量達(dá)200多萬(wàn)噸，占世界年產(chǎn)量的一半左右，產(chǎn)值超百億元人民幣。據(jù)測(cè)算，每生產(chǎn)I噸鮮蘑菇，即可轉(zhuǎn)化I噸養(yǎng)殖業(yè)廢料和2噸種植業(yè)廢料，解決I個(gè)農(nóng)村勞動(dòng)力就業(yè)，因此經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益顯著。
[0003]雙孢蘑菇的栽培起源于法國(guó)，至今已有300多年的歷史，近幾十年來(lái)歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的雙孢蘑菇生產(chǎn)都采用工廠化生產(chǎn)模式，配套以產(chǎn)量高、周期短的工廠化生產(chǎn)專用品種，產(chǎn)品基本都鮮銷。而我國(guó)上世紀(jì)20年代才從國(guó)外引進(jìn)雙孢蘑菇到國(guó)內(nèi)栽培，80年代才形成一定規(guī)模的生產(chǎn)。雖然目前已有一定數(shù)量的工廠化生產(chǎn)廠家，但數(shù)十年來(lái)一直以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)為主，至今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍占到總量的80%以上，產(chǎn)品除鮮銷外，部分還加工成罐頭出口，因此所用的品種也要求以優(yōu)質(zhì)為主、兼顧產(chǎn)量的品種，如本單位選育的As2796系列。因此，具有優(yōu)質(zhì)性狀的雙孢蘑菇種質(zhì)資源及新品種對(duì)我國(guó)的雙孢蘑菇產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。
[0004]在雙孢蘑菇育種技術(shù)上，國(guó)內(nèi)外目前都以雜交育種為主，國(guó)內(nèi)以本單位的同工酶輔助雜交育種為主導(dǎo)技術(shù)，國(guó)外仍以出菇篩選為主。上世紀(jì)90年代以后國(guó)內(nèi)外多家單位均開(kāi)展了 DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，在親緣關(guān)系分析、雜交親本選擇、同核體鑒定等方面得到一定的應(yīng)用，但在關(guān)鍵農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病、抗逆等方面的分析卻鮮有成功的報(bào)道。ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間)是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)。它利用人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸重復(fù)序列引物對(duì)SSR(Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù))之間的DNA序列進(jìn)行半隨機(jī)PCR擴(kuò)增，可獲得豐富的多態(tài)性。我們通過(guò)大規(guī)模的ISSR引物篩選和大量的菌株驗(yàn)證，找到了一個(gè)適用于雙孢蘑菇菌株優(yōu)質(zhì)性狀預(yù)測(cè)的ISSR標(biāo)記與方法。該標(biāo)記與雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)性狀緊密連鎖，利用該分子標(biāo)記能在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定菌株的優(yōu)質(zhì)性狀，而不必經(jīng)過(guò)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的出菇試驗(yàn)，這對(duì)雜交育種中優(yōu)質(zhì)親本選擇與跟蹤鑒定、提高育種效率有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于分子標(biāo)記技術(shù)，建立一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明為一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用，是利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)雙孢蘑菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0007]利用ISSR引物對(duì)雙孢蘑菇菌株基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR，優(yōu)質(zhì)類型的菌株能擴(kuò)增出1600bp和850bp的特異性條帶，所述ISSR引物的核苷酸序列為:5， -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3，。
[0008]所述的ISSR-PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52 °C退火45s，72°C延伸90s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。反應(yīng)體系為:模板DNA 30 ng，引物 30 ng, dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, Taq DNA 聚合酶 I U，I XPCR 緩沖液，用ddH20補(bǔ)總體積至20 μ L0
[0009]所述引物在鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株上的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇菌株的優(yōu)質(zhì)或非優(yōu)質(zhì)特性，該方法耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，無(wú)需出菇，省時(shí)省力。根據(jù)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物1900bp和850bp條帶的有無(wú)來(lái)鑒定菌株的優(yōu)質(zhì)或非優(yōu)質(zhì)性狀，具有該2條帶的菌株為優(yōu)質(zhì)菌株，沒(méi)有該2條帶的菌株為非優(yōu)質(zhì)菌株。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1雙孢蘑菇24個(gè)優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindl 11Markers ；1~24:滬 8213，8211，閩 I 號(hào)，As376，Asl671，Asl789，As321，As555，T-8205，A，D，滬 101，21，22，175，751，福罐 3，福罐 10，廈前 751，仙游 841，滬 102-1，黃巖 62，浣沙 176-4，AglO0右邊箭頭指示2條特異條帶位置，顯示24個(gè)優(yōu)質(zhì)菌株均擴(kuò)增出850bp特異條帶，有22個(gè)擴(kuò)增出1600bp特異條帶。圖中箭頭指示2個(gè)菌株未擴(kuò)增出1600bp條帶。
[0012]圖2雙孢蘑菇24個(gè)非優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindl 11Markers ;25-48:102-2，蘇錫一號(hào)，T-03，111-455，111，浣沙 176，浣沙 176-3，245-6，F(xiàn)4，F(xiàn)20，Ag6，8132D，02，7001，7601，701，Agl8，臺(tái)-1，0072，S46，50-1，125，浣沙 176-2，日本 118。右邊箭頭指示2條特異條帶位置，顯示24個(gè)非優(yōu)質(zhì)菌株均未擴(kuò)增出2條特異條帶。
[0013]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1:
1.Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs購(gòu)自廈門泰京生物有限公司，ISSR引物委托上海生工生物科技有限公司合成。所述ISSR引物的核苷酸序列為:5， -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3，。
[0014]2.雙孢蘑菇DNA提取與電泳
雙孢蘑菇DNA提取與檢測(cè)按照文獻(xiàn)[陳美元，廖劍華，李洪榮，郭仲杰，盧政輝，蔡丹鳳，王澤生.雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，(04):149-156.]。
[0015]3.1SSR-PCR反應(yīng)體系與條件
反應(yīng)體系為:模板 DNA 30 ng，引物 30 ng, dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶I U，I XPCR緩沖液，用ddH20補(bǔ)總體積至20 μ L0擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。PCR產(chǎn)物電泳及染色拍照按照文獻(xiàn)[陳美元，廖劍華，王波，李洪榮，盧政輝，郭仲杰，蔡丹鳳，王澤生.中國(guó)野生蘑菇屬90個(gè)菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].食用菌學(xué)報(bào)，2009，(01):11-16.] ο
[0016]4.結(jié)果分析
ISSR-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2，1-24號(hào)為雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株，其中24個(gè)菌株有22個(gè)擴(kuò)增出1600bp條帶，僅I號(hào)和13號(hào)菌株未擴(kuò)增出，檢出陽(yáng)性率為91.7%, 24個(gè)菌株都擴(kuò)增出850bp條帶，檢出陽(yáng)性率為100%。25-48號(hào)為雙孢蘑菇非優(yōu)質(zhì)菌株，均未擴(kuò)增出1600bp和850bp特異性條帶，2個(gè)條帶的檢出陽(yáng)性率均為0%。因此，該標(biāo)記與雙孢蘑菇菌株的優(yōu)質(zhì)性狀緊密連鎖，應(yīng)用該標(biāo)記與方法可以非常方便地對(duì)雙孢蘑菇菌株的優(yōu)質(zhì)或非優(yōu)質(zhì)性狀進(jìn)行區(qū)分和鑒定。
[0017]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記引物，其特征在于:所述ISSR標(biāo)記引物核苷酸序列為:5’ -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3’。2.如權(quán)利要求1所述引物用于鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記方法，其特征在于:利用ISSR標(biāo)記引物對(duì)雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存；反應(yīng)體系為:模板 DNA 30 ng，引物 30 ng，dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, TaqDNA聚合酶I U，I XPCR緩沖液，用ddH20補(bǔ)總體積至20 μ L03.如權(quán)利要求1所述引物在鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一個(gè)鑒定雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)菌株的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用，利用ISSR引物對(duì)雙孢蘑菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅具有優(yōu)質(zhì)特性的菌株能擴(kuò)增出1600bp和850bp特異片段。本發(fā)明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇優(yōu)質(zhì)類型菌株,而不用經(jīng)過(guò)出菇試驗(yàn)。該方法耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，可以在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定菌株的質(zhì)量性狀，極大地提高了雙孢蘑菇雜交育種的效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/645, C12N15/11, C12Q1/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105200133
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510614637
【發(fā)明人】陳美元, 廖劍華, 蔡志欣, 郭仲杰, 李洪榮, 盧政輝, 王澤生
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月24日