H9亞型禽流感重組鴨腸炎病毒rDEVΔgE-H9株的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及冊亞型禽流感重組鴨腸炎病毒rDEVΔ姐-冊株的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于 病毒學(xué)和獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨腸炎病毒值uckenteritisvirus,DEV)，又名鴨攝病毒，可感染鴨、碟及其它雁 形目禽類，引起血管損傷、組織出血、消化道粘膜損傷、淋己器官受損和實質(zhì)性器官退行性 病變的一種急性、接觸性、敗血性傳染病一一鴨病毒性腸炎值uckviralenteritis,DVE)， 或稱鴨攝值uckplague,DP) (San化uandMetwally, 2008)。自1923年被首次發(fā)現(xiàn)W來 度audet，1923)，本病相繼發(fā)生于法國、印度、比利時、英國、泰國和加拿大等國家（殷震和 劉景華，1997)，流行范圍、感染禽類的種類有逐步擴大的趨勢，至少48種雁形目中的禽類 對DEV易感化aletaet曰1.，2007)。鴨攝是一種廣泛嗜全身性感染的傳染病，發(fā)病率和死 亡率都很高，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。免疫接種是預(yù)防和控制該病暴發(fā)的重要措施，目 前我國用于鴨攝預(yù)防的疫苗主要是上世紀(jì)60年代研究成功的雞胚弱化活疫苗。DEV具有良 好的免疫原性，免疫力產(chǎn)生快速，免疫后3天便可抵抗鴨攝強毒攻擊；免疫期長，可達(dá)一年。
[0003] DEV屬于瘤疹病毒科、甲型瘤疹病毒亞科、馬立克病毒屬、鴨瘤疹病毒1型 (ht1:p://www.ictvonline.org)。李玉峰應(yīng)用Shot-gun方法首次完成了DEV--我國鴨 攝商品化疫苗值EVVAC)的全基因組測序。DEVVAC基因組全長為158,089bp，G+C含量 為44. 91%，由長獨特區(qū)OJniqueLong，UL)和短獨特區(qū)OJniqueShod，U巧組成，US區(qū)兩 端為一對反向重復(fù)序列，分別稱為內(nèi)部重復(fù)序列（InternalRepeat,IR)和末端重復(fù)序列 燈erminalRepeat，TR)?；蚪M結(jié)構(gòu)為UkIR-US-TR，呈典型的D型瘤疹病毒基因組結(jié)構(gòu) (Lietal.，2009)。我們完成了我國鴨腸炎病毒強毒參考株全基因組序列測定，該毒株基 因組全長為162, 13化P，共78個0RF，編碼76個蛋白（Yangetal.，2014)。
[0004] 自1994年在我國廣東某雞場分離到H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)來，該亞型病毒在我 國的雞、鴨、碟等禽類中廣泛流行，一直呈上升趨勢，對鴨致病性逐漸增強，可引起蛋鴨產(chǎn)蛋 量下降，沙殼蛋增多，使維鴨出現(xiàn)呼吸道癥狀和亞臨床癥狀，此外，還可引起免疫抑制，造成 鴨群繼發(fā)大腸桿菌等疾病，對養(yǎng)鴨也造成重大經(jīng)濟損失。 陽0化]隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組病毒活載體疫苗成為當(dāng)前新型疫苗研究的熱點。 利用基因工程技術(shù)，將外源DNA插入到病毒基因重組，利用病毒表達(dá)外源DNA蛋白，制備成 一種活載體疫苗。運種疫苗可W同時啟動機體細(xì)胞和體液免疫，可W通過一次免疫預(yù)防多 種疾病，降低了生產(chǎn)成本，簡化了免疫程序，還能克服不同病毒弱毒疫苗之間的干擾現(xiàn)象。 [0006] 本發(fā)明通過同源重組技術(shù)，構(gòu)建了一株缺失姐基因143-509位核巧酸、帶有GFP 標(biāo)記的重組rDEVΔ姐-GFP，然后應(yīng)用綠色巧光蛋白負(fù)篩選技術(shù)，獲得了表達(dá)冊亞型禽流感 病毒血凝素（HA)基因的重組鴨腸炎病毒rDEVΔ姐-冊。該重組病毒免疫鴨后，能抵抗DEV 強毒株的攻擊，還能誘導(dǎo)較高的H9HI抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)H9亞型禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨腸 炎病毒，即本發(fā)明先構(gòu)建一株缺失姐基因、攜帶綠色巧光蛋白基因（GF巧標(biāo)記的重組鴨腸 炎病毒rDEVΔ姐-GFP株，然后應(yīng)用綠色巧光蛋白負(fù)篩選技術(shù)，獲得了表達(dá)H9亞型禽流感病 毒HA基因的重組鴨腸炎病毒rDEVΔ姐-冊株。將重組鴨腸炎病毒rDEVΔ姐-冊株制備成 活疫苗，可預(yù)防鴨攝和H9亞型禽流感。 陽00引本發(fā)明的技術(shù)方案 W09] 1. -株重組鴨腸炎病毒，其特征在于該毒株被命名為鴨腸炎病毒值uck enteritisvirus,DEV)rDEVA姐-冊株，該病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、保藏，保藏編號為：CGMCCNo.11498。
[0010] 2.如權(quán)利要求1所述一株重組鴨腸炎病毒，其特征在于該毒株的姐基因內(nèi)插入了 冊亞型禽流感病毒血凝素（HA)基因。
[0011] 3.如權(quán)利要求1所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于該毒株作為疫苗生 產(chǎn)毒株應(yīng)用于制備H9亞型禽流感鴨腸炎病毒二聯(lián)活疫苗，預(yù)防H9亞型禽流感和鴨攝。
[0012] 4.如權(quán)利要求1、2所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于是將該株病毒接 種長滿單層的無特定病原雞的雞胚成纖維細(xì)胞，收獲病毒培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真 空干燥制成所述H9亞型禽流感鴨腸炎病毒二聯(lián)活疫苗。
[0013] 5.如權(quán)利要求1、2所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于該株病毒缺失了 姐基因143-509位核巧酸，可在此區(qū)域插入冊亞型禽流感病毒或/和鴨肝炎病毒或/和鴨 黃病毒保護基因并獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)，制備成鴨腸炎病毒為載體的聯(lián)合活疫苗。
【具體實施方式】
[0014] 1.生產(chǎn)用病毒毒種
[0015] 本發(fā)明所述的疫苗其生產(chǎn)毒種為表達(dá)冊亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨腸炎病 毒（rDEVΔ姐-H9株），該病毒構(gòu)建方法如下：
[0016] (1)載體
[0017] PMD-18T載體，用于克隆測序及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，購自寶生物工程（大連）有限公 司。含有CMV啟動子、polyA的GFP報告基因載體pT-GFP-甜t(見圖1)，由本發(fā)明人所在實 驗室構(gòu)建、保存。
[0018] 似引物設(shè)計
[0019] 根據(jù)GenBank上發(fā)表的DEV序列設(shè)計合成W下引物：
[0020] 表1本發(fā)明構(gòu)建所設(shè)及的相關(guān)引物信息
[0021]
[0022] (3)含GFP標(biāo)記的鴨腸炎病毒rDEVΔ姐-GFP株的構(gòu)建
[0023] 1)轉(zhuǎn)移載體ρΤ-姐-GFP-甜t的構(gòu)建
[0024]W鴨腸炎病毒（鴨腸炎病毒值uckenteritisvirus,DEV)CVCCAV1221株）基因 組DM為PCR擴增模板，W引物U姐F、U姐R擴增姐基因的左端13"bp片段。W引物US8F、 US8R擴增姐基因的右端1323bp片段。擴增目的片段分別連接PMD-18T載體，構(gòu)建相應(yīng)的 重組質(zhì)粒ρΤ-姐U和ρΤ-姐d。用Sail和化ndlll雙酶切上述重組質(zhì)粒，分別回收3900bp和 1300bp片段，獲得重組質(zhì)粒ρΤ-姐ud。將重組質(zhì)粒ρΤ-姐ud用Sail酶切，電泳回收后去憐酸 化；pT-GFP-甜t用Sail酶化電泳回收2. 1化片段，將GFP-甜t表達(dá)盒插入到ρΤ-姐ud中， 獲得轉(zhuǎn)移載體ρΤ-姐-GFP-甜t。 陽0巧]2)同源重組
[0026] 按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）盒說明書，將轉(zhuǎn)移載體 ρΤ-姐-GFP-gpt與DEV進(jìn)行轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CE巧。具體步驟如下：
[0027] 六孔板中的C邸培養(yǎng)至長成70%~90%細(xì)胞單層時，接種適量的DEV，吸附1~ 4小時；將1μg轉(zhuǎn)移載體稀釋于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的終體積 均為50μレ室溫解育5min;取2μΙLipofectamine2000與48μΙ不含血清和抗生素的 opti-DMEM輕輕混勻，室溫解育5min;將50μLLipofectamine2000稀釋液分別滴加到 50μΙ質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫解育20min。在此期間，將六孔板中的細(xì)胞用無血 清0PTI-MEM輕輕洗兩遍后，每孔加入0. 5血無血清0PTI-MEM，將100μLLipofectamine 2000/DNA復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖動使其均勻混合，置37°C培養(yǎng)4h，棄去上清， 加入10%胎牛血清的^99培養(yǎng)基，置37°(：培養(yǎng)2地后，用1%胎牛血清的^99培養(yǎng)基換 液，置37°C培養(yǎng)3~5d，每天觀察，直至出現(xiàn)重組病毒巧光斑。
[0028] 3)重組病毒的蝕斑純化
[0029] 將初步獲得的重組病毒接種已長成良好細(xì)胞單層的6孔板C邸細(xì)胞，吸附1小時 后，棄去吸附液，鋪上1 %的低烙點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時后在巧光顯微鏡下觀察 綠色巧光，挑選單個巧光蝕斑于0. 5mlM199營養(yǎng)液中，凍融1次后接種6孔板C邸細(xì)胞，如 此進(jìn)行蝕斑純化3~4次，將獲得的重組病毒命名為rDEVΔ姐-GFP。
[0030] 4)重組病毒rDEVΔ姐-GFP株的鑒定
[0031] 采用RE-姐-JD-F1、RE-姐-JD-R1特異性引物進(jìn)行PCR擴增鑒定，PCR產(chǎn)物測序證 實，重組病毒缺失了姐基因，并成功插入了GFP標(biāo)記基因。 陽