一種cd3ak細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明設及細胞培養(yǎng)技術領域，特別設及一種CD3AK細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方 法。
【背景技術】
[0002] CD3AK細胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指淋己 細胞等單個核細胞經抗CD3單克隆抗體（CD3McAb)激活后的殺傷細胞，在激活后，無需 CD3McAb持續(xù)存在，小劑量外源性的IL-2就可W維持其活性增殖，是WCD3+CD8叮為主的異 質性細胞群，其前體細胞來源豐富，主要是T細胞，W其存活時間長，較低的IL-2依賴性。
[0003]CD3AK細胞具有廣譜殺瘤活性，其殺傷腫瘤細胞是W其偽足和突起與祀細胞緊密 結合，祀細胞的死亡形式是調亡和溶解壞死，其抗瘤作用優(yōu)于LAK細胞，成為繼LAK和TIL 之后，腫瘤AIT研究中最受關注的腫瘤效應細胞。CD3AK細胞具有比LAK細胞和TIL更強 的擴增及抗腫瘤能力，體外抗腫瘤能力比常規(guī)LAK高6~20倍，對NK細胞敏感和LAK細胞 敏感的腫瘤細胞均有不同程度的殺傷效應。能夠有選擇地直接或間接殺傷腫瘤細胞，但對 自體或異體轉化的淋己細胞和正常組織細胞沒有殺傷活性，對人體沒有毒副作用。CD3AK 細胞能夠第一時間糾正患者的免疫功能，提高腫瘤患者對手術、放療和化療的耐受，并且可 W消滅殘存腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞的生長、分化、浸潤，預防癌癥復發(fā)有重要的意義，所W CD3AK細胞在腫瘤治療方面有著重要的應用前景和價值。
[0004]目前，對于CD3AK細胞的培養(yǎng)技術主要是采用廝血分離淋己細胞，經CD3McAb和 IL-2誘導CD3AK細胞，加入胎牛血清。但該方法存在一定的缺陷，如雖然細胞擴增數(shù)量較 大，但是細胞的殺傷活性較低。因此，急需提供一種既能大量擴增CD3AK細胞的數(shù)量，又能 提高細胞的殺傷活性的CD3AK細胞培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種CD3AK細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法。該CD3AK細 胞培養(yǎng)組合物可促進CD3AK細胞的增殖，提高對腫瘤細胞的殺傷活力。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種CD3AK細胞培養(yǎng)組合物，包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、 漢黃琴素、血清和基礎培養(yǎng)基。
[0008] 本發(fā)明將CDMcAb、比-2、IL-15、田屯皂巧、漢黃琴素、血清添加入基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng) CD3AK細胞，可促進CD3AK細胞的增殖，提高對腫瘤細胞的殺傷活力，且CD3AK細胞的純度較 局。
[0009] 作為優(yōu)選，組合物中各組分用量為：
[0010] CDMcAb IO~-50 H gZmL lL-2 100~300U/mL 山-15 10、'30U/mL 田七皂普 10~50mg/mL 漢黃萃素 0.2~6mg/L 血清 2%-^0%體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0011] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0012] CDMcAb 10 UgZmL IL-2 lOOU/iriL 比巧 lOU/mL 田七皂每 lOmg/mL 漢黃茶素 0.2mg/L 血清 2〇/。體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0013] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0014] CDMcAb 50 U g/mL 1L-2 300U/niL
[0015] 圧-15 30U/niL 田毛皂魯 50nig/niL 漢黃茶素 6mg/L 血證 20%體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0016] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，本發(fā)明培養(yǎng)組合物中各組分用量為：
[0017] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL 化.-15 20U/inL 巧七皂皆 SOrngZmL 漢黃零素 3mg/L 血清 10%體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0018] 作為優(yōu)選，基礎培養(yǎng)基為RPMI-1640基礎培養(yǎng)基。
[0019] 作為優(yōu)選，血清為自體血清。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種CD3AK細胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0021] 采用基礎培養(yǎng)基將PBMC重懸，加入CDMcAb、比-2、比-15、田屯皂巧、漢黃琴素和血 清，進行細胞培養(yǎng)，每隔3天補液一次，獲得CD3AK細胞。
[0022] 作為優(yōu)選，本發(fā)明CD3AK細胞培養(yǎng)方法中各組分用量為：
[0023] CDMcAb KK50 |i g/rriL 比-2 100--300U/mL IL-15 10~30U/mL 田七皂普 KK50mg/mL 漢黃茶素 0.2~6mg/L 血清 2%~20%體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0024] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[00巧] CDMcAb lOlig/rnL 1L-2 lOOU/mL 山-15 lOU/mL
[0026] 巧毛皂普 1 Omg/mL 漢黃茶素 0.2mg/L 血清 2〇/〇體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0027] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[0028] CDMcAb 50 U g/inL IL-2 300U/mL ILl 5 30UAiiL 田"t:皂普 SOmgZmL 漢黃茶素 6mg/L 血清 20%體積分數(shù) 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0029] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，本發(fā)明組合物中各組分用量為：
[0030] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL IL-15 20U/mL 田七皂普 30mg/mL 漢黃茶素 3mg/L 血簿 ！0%體轉分獄， 基礎培養(yǎng)基 余量。
[0031] 作為優(yōu)選，基礎培養(yǎng)基為RPMI-1640基礎培養(yǎng)基。
[0032] 作為優(yōu)選，血清為自體血清。
[0033] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，細胞培養(yǎng)的條件為37°C、濃度為5%的0)2。
[0034] 作為優(yōu)選，PBMC的接種密度為（1~10)XIO6個/mL。
[003引在本發(fā)明提供的一些實施例中，PBMC的接種密度為1XIO6個/mL。
[0036] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，補液為：補加基礎培養(yǎng)基、CDMcAb、比-2、IL-15、田 屯皂巧、漢黃琴素，CDMcAb終濃度為10~50yg/mL，IL-2終濃度為100~300U/mL，比-15 終濃度為10~30U/血，田屯皂巧終濃度為10~50mg/mU漢黃琴素終濃度為0. 2~6.Omg/ L補液后細胞密度在（0. 5~1. 0)XIO6個/mL。
[0037] 作為優(yōu)選，細胞培養(yǎng)的天數(shù)為7~10天。
[0038] 本發(fā)明提供了一種CD3AK細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法。該CD3AK細胞培養(yǎng)組合 物包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、漢黃琴素、血清和基礎培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如 下優(yōu)勢之一：
[0039] 1、本發(fā)明CD3AK細胞培養(yǎng)組合物可促進CD3AK細胞的大量增殖，并且提高其細胞 的殺傷活性；
[0040] 2、本發(fā)明采用自體血清來促進細胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；
[0041] 3、本發(fā)明只需較低劑量的IL-2,大大降低了生產成本；
[0042] 4、本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來的CD3AK細胞純度較高。
【附圖說明】
[0043] 圖1是本發(fā)明培養(yǎng)方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的CD3AK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性 檢測結果。
【具體實施方式】
[0044] 本發(fā)明公開了一種CD3AK細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法，本領域技術人員可W借 鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域 技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過 較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述 的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[004引術語解釋：
[0046]CDMcAb:CD3AK細胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指 淋己細胞等單個核細胞經抗CD3單克隆抗體（CD3McAb)激活后的殺傷細胞，在激活后，無需 CD3McAb持續(xù)存在，小劑量外源性的IL-2就可W維持其活性增殖，是WCD3+CD8+T為主的異 質性細胞群，其前體細胞來源豐富，主要是T細胞，W其存活時間長，較低的IL-2依賴性。
[0047] 比-2 :即白細胞介素-2(interle址in-2,比-2)，又名T細胞生長因子燈cell growthfactor,TCRF)。主要由活化的CD4+Thl細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子。 可促進ThO和CTL的增殖，故為調控免疫應答的重要因子，也參與抗體反應、造血和腫瘤監(jiān) 視。環(huán)抱素、他克莫司等免疫抑制劑可W抑制其活性和生成。
[0048] 比-15:即白細胞介素-15(interle址in-15,比-15)，由多種細胞產生，生物學作 用與IL-2相似。其細胞來源和祀細胞分布較IL-2廣，故可能在不表達IL-2的部位發(fā)揮類 似IL-2的效應。
[0049] 田屯皂巧：是從S屯提取的S屯皂巧，包括人參皂巧化1、人參皂巧RgUS屯皂巧 Rl等，能增加腦血管流量，擴張腦血管，改善血流動力學，降低腦缺血。
[0050] 漢黃琴素：又名5, 7-二徑基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并巧喃-4-酬，是一 種溶于有機溶劑而不溶于水的黃色針狀結晶物。用小鼠切除的小腸實驗表明有磐粟堿樣的 解疫作用，但作用較弱，約為磐粟堿的五分之一。大鼠口服可降低乙醇所致的甘油=酸醋水 平。還具有抗癌作用、利尿作用。
[0051]外周血單個核細胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):即外周血中具 有單個核的細胞，包括淋己細胞和單核細胞。
[0052]本發(fā)明提供的CD3AK細胞培養(yǎng)組合物及其培養(yǎng)方法中所用CDMcAb、細胞因子、培 養(yǎng)基、中藥成分均可由市場購得。
[0053] 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0054] 實施例1CD3AK細胞的培養(yǎng) [00巧]1、外周血單個核細胞的分離
[005引采集50~1