一種病毒核酸裂解液及其在利用硅膠膜吸附柱提取病毒核酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸裂解液及其應(yīng)用，尤其涉及一種用于從全血、血漿或血清微 量樣本中快速提取病毒核酸的裂解液及其在利用硅膠膜吸附柱提取病毒核酸中的應(yīng)用。屬 于核酸純化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸的提取純化是進(jìn)行分子生物學(xué)各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)，特別是在分子診斷領(lǐng)域， PCR、RT-PCR、Northern blot、RT-qPCR、cDNA文庫構(gòu)建、酶切等技術(shù)手段都需要純度高、完整 性好的核酸。但由于外源及內(nèi)源性核酸酶的存在及其酶活性相對穩(wěn)定等原因，使得提取和 純化高質(zhì)量的核酸相對比較困難。核酸裂解液在核酸的提取純化過程中對樣本裂解和對最 終所得核酸的質(zhì)量和得率有很大的影響，因此研發(fā)高效快速、回收范圍廣、得率高的核酸裂 解液是本領(lǐng)域不斷探索的課題。
[0003] 目前市場上用于核酸提取的裂解液種類較多，常見的有經(jīng)典的TRIzol、 CTAB-LiCl、堿裂解液等。TRIzol含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞 內(nèi)源性核酸酶，保持提取核酸的完整性；但是其實(shí)用時操作繁瑣、費(fèi)時，提取微量樣本中核 酸的效果不佳。CTAB-LiCl在低離子強(qiáng)度的溶液中可與核酸形成不溶的復(fù)合物，有利于去除 多糖、酚類等雜質(zhì)，常被用來提取植物樣本材料的核酸，有局限性。堿裂解是最古老的核酸 的提取方法，但利用該法使用的堿裂解液裂解所得的核酸含有大量雜質(zhì)，嚴(yán)重干擾下游實(shí) 驗(yàn)。經(jīng)檢索，針對從全血、血漿或血清等微量樣本中快速提取病毒核酸的裂解液及其在利用 硅膠膜吸附柱法提取病毒核酸中的應(yīng)用還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種用于從全血、血漿或血清微量樣本中快 速提取病毒核酸的裂解液及其在利用硅膠膜吸附柱提取病毒核酸中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述用于從全血、血漿或血清微量樣本中快速提取病毒核酸的裂解液，其 特征在于：所述裂解液的組分及含量是：
[0006] 每升50mM ρΗ6· 0的Tris-HCl緩沖液中含有
[0007] 十二烷基硫酸鎖 1.3 g/L TrilionX-100 6~39 mL/L 乙二胺四乙酸二鈉 12.14 g/L 氯化鋰 15.63 g/L 鹽酸胍 480~561 g/L 檸檬酸鈉 5 g L
[0008] 裾以((;丨 ycogen) 28.2mg./L 蛋白酶K 20 g/L 〇：
[0009] 上述用于從全血、血漿或血清微量樣本中快速提取病毒核酸的裂解液，其優(yōu)選的 組分及含量是：
[0010] 每升50mM ρΗ6· 0的Tris-HCl緩沖液中含有
[0011] 十二烷基硫酸鈉 1.3 g/L TrillonX-100 30 mL/L 乙二胺四乙酸二鈉 12.14 g/L 氯化鋰 15.63 g/L 鹽酸胍 480 g/L 檸檬酸鈉 5 g/L 糖'h.:UGIycogeri) 28,2 mg/L 蛋白酶K 20 g/L B
[0012] 上述裂解液的配制方法是：
[0013] 分別稱取十二烷基硫酸鈉1.3g、乙二胺四乙酸二鈉12. 14g、氯化鋰15.63g、 鹽酸胍480g、梓檬酸鈉5g、糖原（Glycogen) 28. 2mg、蛋白酶K 20g，置于大燒杯中，加 入800mL 50mM pH6.0的Tris-HCl緩沖液后磁力加熱攪拌至充分溶解，然后加入30ml TritionX-100,40°C水浴1小時，待徹底溶解后再滴加50mM pH6. 0的Tris-HCl緩沖液，定 容至體積總量為1L。
[0014] 本發(fā)明所述的裂解液在利用硅膠膜吸附柱提取全血、血漿或血清微量樣本中病毒 核酸的應(yīng)用。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述利用硅膠膜吸附柱提取全血、血漿或血清微量樣本中病毒核酸 的方法是：
[0016] (1)取含病毒顆粒的全血、血清或血漿樣本，相應(yīng)加入等體積量的本發(fā)明所述的裂 解液，渦旋震蕩，待徹底混勻后56°c水浴15min ;
[0017] (2)向上述裂解混合物中加入其1. 3~1. 4倍體積量的無水乙醇，震蕩混勻，再室 溫靜置后轉(zhuǎn)入硅膠膜吸附柱中8000r/min離心lmin，棄廢液；
[0018] (3)向硅膠膜吸附柱中分別依次加入去蛋白液、漂洗液和無水乙醇，其間分別進(jìn)行 8000r/min離心lmin，棄廢液；
[0019] (4)把硅膠膜吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的收集管中，12000r/min離心3min，然后將吸附 柱置50°C開蓋干燥2~5min，以徹底去除吸附材料中的無水乙醇；
[0020] (5)把干燥后的硅膠膜吸附柱放入另一潔凈的離心管中，在吸附柱中央加入50~ 100 μ L無核酸酶的水，室溫靜置5~lOmin，12000r/min離心lmin，收集濾液，即得到病毒 核酸溶液。
[0021 ] 上述方法中所述的去蛋白液和漂洗液，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的常規(guī)試 劑。其中，去蛋白液各組分及其含量為：
[0022] 鹽酸胍 477. 65 ~561. 25g/L
[0023] 無水乙醇 570 ~600mL/L
[0024] 上述去蛋白液的配制方法是：將所述各組分稱量后，加20mM pH6. 0的Tris-HCl緩 沖液混合，使混合液體積總量為1L。
[0025] 漂洗液各組分及其含量為：
[0026] 氯化鈉 2. 93 ~4. 85g/L
[0027] 無水乙醇 800mL/L
[0028] 上述漂洗液的配制方法是：將所述各組分稱量后，加20mM pH6. 0的Tris-HCl緩沖 液混合，使混合液體積總量為1L。
[0029] 本發(fā)明提出一種性質(zhì)溫和且高效的適用于全血、血漿或血清等微量樣本中快速提 取病毒核酸的裂解液及其在利用硅膠膜吸附柱法提取病毒核酸中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目 的，本發(fā)明人在查找閱讀國內(nèi)外病毒核酸提取文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選和優(yōu)化，確 立了一種用于從全血、血漿或血清微量樣本中快速提取病毒核酸的裂解液配方，實(shí)現(xiàn)了從 體系中輕松捕獲微量病毒核酸，具有方便快捷、產(chǎn)量高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使用 本發(fā)明的裂解液，利用硅膠膜吸附柱提取病毒核酸僅需30分鐘，病毒核酸得率高、純度好， 純化的病毒核酸可用于熒光定量分析、體外翻譯和分子克隆等等多種下游實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明結(jié) 合裂解液特點(diǎn)還提供一種利用本發(fā)明的裂解液提取純化血漿或血清等微量樣本中病毒核 酸的方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比，具有的突出優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：
[0030] a.獨(dú)特的針對病毒核酸提取的裂解液，蛋白酶解和化學(xué)裂解同時進(jìn)行，既避免了 酶解效率低的問題，也不會因常規(guī)的化學(xué)裂解反應(yīng)劇烈導(dǎo)致核酸受到破壞；
[0031] b.裂解液中含有核酸共沉淀劑，在特定的pH下可以從樣本中輕松捕獲微量病毒 核酸，所得核酸回收率高；
[0032] c.操作流程簡潔，30min內(nèi)即可完成病毒核酸的提取純化，比現(xiàn)有的大多數(shù)商品 化試劑盒都省時省力。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中所述的分別利用3名丙型肝炎患者抽取的血清提取HCV RNA的電泳檢測。
[0034] 其中，泳道1、2、3為使用本發(fā)明的裂解液提取純化的HCV核糖核酸。泳道Μ為脫 氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000 Ladder)。
[0035] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中所述的分別利用5名乙型肝炎患者抽取的血清提取HBV DNA的電泳檢測。
[0036] 其中，泳道1、2、3、4、5為使用本發(fā)明試劑提取純化的HBV脫氧核糖核酸。泳道Μ 為脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000 Ladder)。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1 :本發(fā)明所述核酸提取裂解液、去蛋白液和漂洗液的配制；
[0038] 裂解液的配制方法是：
[0039] 分別稱取十二烷基硫酸鈉1.3g、乙二胺四乙酸二鈉12. 14g、氯化鋰15. 63g、 鹽酸胍480g、梓檬酸鈉5g、糖原（Glycogen) 28. 2mg、蛋白酶K 20g，置于大燒杯中，加 入800mL 50mM pH6.0的Tris-HCl緩沖液后磁力加熱攪拌至充分溶解，然后加入30ml TritionX-100,40°C水浴1小時，待徹底溶解后再滴加50mM pH6. 0的Tris-HCl緩沖液，定 容至體積總量為1L。
[0040] 去蛋白液的配制方法是：
[0041] 量取570mL無水乙醇，備用；稱取鹽酸胍480g，加入430mL 20mM pH6. 0的 Tris-HCl緩沖液，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加?70mL無水乙醇，使混合液體積總量為1L ;
[0042] 漂洗液的配制方法是：
[0043] 量取800mL無水乙醇，備用；稱取氯化鈉3. 0g，加入200mL 20mM pH6. 0的 Tris-HCl緩沖液，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加?00mL無水乙醇，使混合液體積總量為1L。
[0044] 實(shí)施例2 :從三例丙肝患者樣本的血清中提取HCV RNA
[0045] 應(yīng)用實(shí)施例1配