靶向o-乙?；膅d2神經(jīng)節(jié)苷脂作為針對(duì)癌癥干細(xì)胞的新型治療和診斷策略的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明設(shè)及用于治療和/或診斷癌癥干細(xì)胞（CSC)癌的抗體、藥物組合物和方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引 癌癥干細(xì)胞
[0004] 最近數(shù)十年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展使現(xiàn)有的癌癥治療策略取得了重要的改善。在不 斷的研究和應(yīng)用包括化療、放療、激素療法和外科手術(shù)的常規(guī)治療策略的同時(shí)，出現(xiàn)了通常 被稱為"祀向癌癥治療"的新的癌癥控制方法并顯示出其在醫(yī)療領(lǐng)域的效率和利益。運(yùn)些 祀向療法包括針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體，例如曲妥珠單抗（抗-Her2Neu)、利妥昔單抗 (抗-CD20))或貝伐單抗（抗-VEGF)，W及酪氨酸激酶抑制劑（例如，伊馬替尼、厄洛替尼、 吉非替尼）、CDK抑制劑等。運(yùn)些新的癌癥治療方案在很大程度上改善了患者的生活，并且 相比于多數(shù)常規(guī)策略具有增加的存活率和減小的副作用。然而，運(yùn)些祀向治療策略也迅速 顯示出局限性，尤其是由于對(duì)所述治療的抗性，W及運(yùn)些祀向治療的特異性，其并不是對(duì)于 每一種類(lèi)型的癌癥和患者都是有效的。運(yùn)些抗性治療現(xiàn)象導(dǎo)致治療失敗、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、再發(fā)和 復(fù)發(fā)。
[0005] 研究表明，運(yùn)些抗性的根本原因可能是癌癥干細(xì)胞（CSC)的存在，其是能夠自我 更新和分化的癌細(xì)胞的一個(gè)小亞組，并且在癌癥抵抗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起根本性作用。事實(shí) 上，運(yùn)些癌癥干細(xì)胞顯示出對(duì)于癌癥治療（包括放療和化療）的相對(duì)抵抗。此外，僅僅少量 的運(yùn)些癌癥干細(xì)胞就足W引發(fā)新的腫瘤，并由此發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，直接祀向運(yùn)些癌癥干細(xì)胞 可W改善目前癌癥治療策略的效力。
[0006] 由此已經(jīng)深入研究了癌癥干細(xì)胞和相關(guān)的機(jī)制。已經(jīng)研究了鑒定運(yùn)樣的癌癥干細(xì) 胞的方法，并且發(fā)現(xiàn)了幾種CSC標(biāo)志物。遺憾的是，仍然沒(méi)有被鑒定為可用于許多癌癥類(lèi)型 的CSC標(biāo)志物的抗原。目前使用CSC標(biāo)志物的實(shí)例包括ALDH、CD133、CD44、CD24、CD166。 在不同類(lèi)型的癌癥中，已鑒定了許多不同表型為CSC表型。尤其是，現(xiàn)今CD133被廣泛用作 癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物，其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出是良好的CSC標(biāo)志物。
[0007] 現(xiàn)在，細(xì)胞表型CD133+與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的癌癥干細(xì)胞相關(guān)；表型CD44 +CD24 顯 示出與乳腺癌中的癌癥干細(xì)胞相關(guān)；表型CD34+顯示出與白血病中的癌癥干細(xì)胞相關(guān)；更 具體地，CD347CD38與急性髓細(xì)胞白血病中的癌癥干細(xì)胞相關(guān)；W及表型CD347CD19+顯示 出與急性淋己細(xì)胞白血病中的癌癥干細(xì)胞相關(guān)。
[0008] 遺憾的是，大多數(shù)已知的CSC標(biāo)志物在正常組織中也表達(dá)。因此，最關(guān)注的是確定 能夠被用作診斷和治療CSC標(biāo)志物的特定癌癥標(biāo)志物：其能夠出于診斷目的而被祀向，并 且還能夠用于治療包含癌癥干細(xì)胞的癌癥（本文中稱為癌癥干細(xì)胞癌癥（CSC癌）），而不會(huì) 出現(xiàn)由于對(duì)健康細(xì)胞的毒性而造成的副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)示出了神經(jīng)外胚層起源的癌癥特異性表達(dá)GD2-0-乙酷化的 神經(jīng)節(jié)巧脂，并且能夠通過(guò)給藥?kù)胂騁D2-0-乙酷化的神經(jīng)節(jié)巧脂的治療性抗體而顯示出 有益效果，且不具有神經(jīng)毒性，尤其是由于該癌癥抗原在健康細(xì)胞上不表達(dá)，尤其是在外周 神經(jīng)上不表達(dá)。
[0010] 現(xiàn)在，發(fā)明人出人意料地示出了該GD2-0-乙酷化的神經(jīng)節(jié)巧脂在癌癥干細(xì)胞中 強(qiáng)烈表達(dá)，并且能夠被祀向W用于CSC癌治療。
[0011] 因此，發(fā)明人提出了利用特異于0-乙酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂的8B6抗體（和其 衍生物）祀向0-乙酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂W用于治療CSC癌。
[0012] 在其研究中，他們證明了該抗體顯示出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的固有強(qiáng)效細(xì)胞毒活性，除 了免疫效應(yīng)（包括CDC和ADCC)之外，還包括通過(guò)細(xì)胞調(diào)亡或其他細(xì)胞死亡通路的直接細(xì) 胞毒性。
[0013] 因此，本發(fā)明設(shè)及用于治療治療癌癥干細(xì)胞（CSC)癌癥的識(shí)別0-乙酷化的-GD2 神經(jīng)節(jié)巧脂的抗體，或其功能性片段，所述抗體包含：
[0014] a)輕鏈，至少包含來(lái)自免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)框架和由序列SEQIDNO: 1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:3限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll， 沈QIDN0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0015] b)重鏈，至少包含免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)框架和由序列SEQIDN0:4、SEQID N0:5、SEQIDN0:6限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl，沈Q IDN0:5 限定CDR-肥，沈QIDN0:6 限定CDR-冊(cè)。
[0016] 本發(fā)明還設(shè)及用于治療CSC癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的抗 體。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及用于診斷受試者中CSC癌的方法，其中所述方法包括確定0-乙 酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂的表達(dá)，并且其中該0-乙酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂的表達(dá)是CSC癌 的指征。
[0018] 本發(fā)明還設(shè)及0-乙酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂作為CSC癌的生物標(biāo)志物的用途。
[0019] 最后，本發(fā)明設(shè)及預(yù)測(cè)患有CSC癌的受試者對(duì)用本發(fā)明的抗體或組合物進(jìn)行的 治療的應(yīng)答的方法，其中所述方法包括檢測(cè)所述受試者的生物學(xué)樣品中表達(dá)0-乙酷化 的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂的細(xì)胞的存在。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :用對(duì)照IgG3抗體作為陰性對(duì)照染色的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤切片的代表性照片（A); 用mAb8B6染色的神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤切片度）。根據(jù)mAb8B6染色的比強(qiáng)度（specific intensity)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品進(jìn)行評(píng)分1+(C)、化值）、3+膽)、和4+膽)。 陽(yáng)02U 圖2 :0AcGD2在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞中鑒定了CD133可細(xì)胞表型。UL，左上角， 0ACGD2+U87MG人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；UR，右上角，CD133+0AcGD2+U87MG人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì) 胞；LL，左下角，CD133 0AcGD2U87MG人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；LR，右下角，CD133+U87MG人膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞。
[0022] 圖3 :暴露于50μg/ml對(duì)照抗體或mAb8B6的U87MG人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的相差 顯微鏡檢查。在24小時(shí)的解育期后，在相差顯微鏡下W相同的放大率X200觀察由形態(tài)變 化評(píng)價(jià)的調(diào)亡細(xì)胞。箭頭指示調(diào)亡細(xì)胞。
[0023] 圖4 :抗-0AcGD2mAb在小鼠中抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)。
[0024] 圖5 :抗-GD2和抗-0AcGD2抗體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在逐漸增加的鼠 抗-GD2 (10B8)和抗-0AcGD2 (8B6)抗體濃度下通過(guò)MTT測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)直接細(xì)胞毒性。 陽(yáng)0巧]圖6 :小細(xì)胞肺癌中CSC中0AcGD2的表達(dá)。同時(shí)具有0AcGD2 (8B6)或GD2 (10B8) 的CD133 (CSC)的H196細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)中的表達(dá)譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)巧的治療策略
[0027] 本發(fā)明的第一個(gè)目的設(shè)及用于治療癌癥干細(xì)胞（CSC)癌的識(shí)別0-乙酷化的-GD2 神經(jīng)節(jié)巧脂的抗體，或其功能性片段，所述抗體包括： 陽(yáng)02引 a)輕鏈，至少包含來(lái)自免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)框架和由序列SEQIDNO: 1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:3限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll， 沈QIDN0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0029] b)重鏈，至少包含來(lái)自免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)框架和由序列SEQIDNO:4、SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl， 沈QIDN0:5限定CDR-肥，沈QIDN0:6限定CDR-冊(cè)。
[0030]
[0031] 所述CDR根據(jù)IMGT系統(tǒng)命名法來(lái)定義，其是本領(lǐng)域公知的（TheInternational ImmunogeneticsInformationSystem巧、LEFRANC等人，NucleicAcidsResearch,vol. 27 ,p:209-212, 1999)〇
[0032] 術(shù)語(yǔ)"抗體"作為其本領(lǐng)域一般含義是指對(duì)應(yīng)于包含四條膚鏈的四聚體免疫球蛋 白分子，運(yùn)四條膚鏈為通過(guò)二硫鍵相連的兩條完全相同重（H)鏈（全長(zhǎng)為約50-70kDa)和 兩條完全相同的輕（L)鏈（全長(zhǎng)為約25kDa)。輕鏈被分類(lèi)為K和λ。重鏈被分類(lèi)為丫、 μ、α、δ或ε，并將抗體的同種型分別定義為IgG、IgM、IgA、I曲和I姐。每條重鏈由N-端 重鏈可變區(qū)（在本文中縮寫(xiě)為HCVR)和重鏈恒定區(qū)組成。對(duì)于IgG、I曲、和IgA,重鏈恒定 區(qū)由Ξ個(gè)結(jié)構(gòu)域（CHI、C肥、和C冊(cè)）和較鏈區(qū)組成；對(duì)于IgM和I姐，重鏈恒定區(qū)由4個(gè)結(jié) 構(gòu)域（CH1、C肥、C冊(cè)、和CH4)組成。每條輕鏈由N-端輕鏈可變區(qū)（在本文中縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR) 和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域（CL)組成。HCVR和LCVR區(qū)能夠進(jìn)一步細(xì) 分為高度可變的區(qū)域，被稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，散置有更加保守的區(qū)域，其被稱為框架區(qū) (FR)。每個(gè)肥VR和LCVR由Ξ個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，W如下順序從氨基端至簇基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根據(jù)公知規(guī)則為每個(gè)區(qū)域分配氨基酸?？贵w結(jié)合于 特定抗原的功能性能力取決于每個(gè)輕鏈/重鏈對(duì)的可變區(qū)，并且在很大程度上由CDR決定。
[0033] 在一種特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含：
[0034] a)輕鏈，包含來(lái)自免疫球蛋白的輕鏈框架和由序列SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、 沈QIDN0:3限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:1限定CDR-Ll，沈QID N0:2 限定CDR-L2,SEQIDN0:3 限定CDR-L3,和 / 或
[0035] b)重鏈，包含來(lái)自免疫球蛋白的重鏈框架和由序列SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、 SEQIDN0:6限定的Ξ個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)，其中序列沈QIDN0:4限定CDR-Hl，沈QID NO:5限定CDR-肥，沈QIDNO:6限定CDR-冊(cè)。
[0036] 在更特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含包括氨基酸序列SEQIDNO:7的輕鏈 可變區(qū)化CVR)和包括氨基酸序列SEQIDNO:8的重鏈可變區(qū)化CVR)。所述抗體為8B6抗 體。
[0037]
[0038] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"本質(zhì)上是指單克隆抗體。單克隆抗體可W是人抗 體、嵌合抗體和/或人源化抗體。
[0039] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"功能片段"是指能夠識(shí)別0-乙酷化的-GD2神經(jīng)節(jié)巧脂的 抗體片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠簡(jiǎn)單地識(shí)別或生產(chǎn)運(yùn)樣的片段，其包括：舉例而言，F(xiàn)gb片段 (可由木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生）、Fgb'片段（可由胃蛋白酶消化和部分還原產(chǎn)生）、尸(。,'）2片段 (可由胃蛋白酶消化產(chǎn)生）、F。。,（可由血漿酶消化產(chǎn)生）、Fd(可由胃蛋白酶消化、部分還原 和重聚合產(chǎn)生），W及SCFy(單鏈Fy，由分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生）片段、雙價(jià)抗體和單價(jià)抗體。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"雙價(jià)抗體"是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含連接于 相同多膚鏈（VH-化）中的輕鏈可變區(qū)（VL)的重鏈可變區(qū)（VH)。優(yōu)選地，通過(guò)利用太短W 使得同一條鏈上的運(yùn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能夠配對(duì)的接頭，將運(yùn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互 補(bǔ)結(jié)構(gòu)域強(qiáng)行配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0041] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"單價(jià)抗體"是指抗原結(jié)合分子，其具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域 而