產(chǎn)l-異亮氨酸微生物和使用該微生物生產(chǎn)l-異亮氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強能力的微生物，并且涉及使用該微生物 生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法。
【背景技術】
[0002] L-氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單元，并且被廣泛地用作動物的功能性食品添加 劑和營養(yǎng)源，并且被廣泛地用于制藥工業(yè)。在20種氨基酸中，支鏈氨基酸由3個結構 單元（member)--L-繳氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸--組成，并且其工業(yè)價值正 逐步增加。據(jù)報道，支鏈氨基酸在維持和形成人骨骼肌、和行使調(diào)節(jié)胰島素的功能、以 及維持和增加肌肉質(zhì)量方面起到重要作用（Andrea tom等，（2006)The journal of nutrition, 136, 324s-330s)。特別地，L-異亮氨酸在肌肉中代謝以產(chǎn)生能量，并且參與血 紅蛋白生產(chǎn)，并且減輕疲勞和促進生長。因而，它用于多種應用，其包括可注射流體和營養(yǎng) 物，并且它在運動營養(yǎng)食品中的應用也正與日倶增。
[0003] 為了工業(yè)化生產(chǎn)L-異亮氨酸，谷氨酸棒狀桿菌被用作代表性微生物。此微生物 從作為前體的丙酮酸和2- 丁酮酸經(jīng)由三種中間代謝物生產(chǎn)L-異亮氨酸（見圖1)。從兩 種前體合成2-乙?；?2-羥基丁酸，并且由此合成2, 3-二羥基-3-甲基戊酸酯和2-酮 基-3-甲基戊酸酯，并且最終產(chǎn)生L-異亮氨酸。使用酶一一乙酰羥酸合酶、乙酰羥酸還原 異構酶（isomeroreductase)、二輕酸脫水酶和轉氨酶--來生產(chǎn)每一個代謝物（Jin Hwan Park 等，Appl microbial biotechnol， （2010)85:491-506)。
[0004] 在谷氨酸棒狀桿菌菌株中，在L-異亮氨酸生物合成步驟中重要的乙酰羥酸 合酶是由ilvBN基因編碼的，并且經(jīng)受最終產(chǎn)物L-異亮氨酸的反饋抑制，使得基因的 表達和酶的活性被抑制。另外，產(chǎn)生2-丁酮酸的蘇氨酸脫氫酶也經(jīng)受L-異亮氨酸的 反饋抑制。因而，已知的是，參與L-異亮氨酸生物合成的基因表達和酶活性的調(diào)控對 生成以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株是關鍵的（Jin hwan park等，Biotechnology journal, (2010)560-577)。另外，如圖1中可見，通過相同的生物合成途徑生產(chǎn)L-異亮 氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸。因而，為了大量生產(chǎn)L-異亮氨酸，應該充分地供應用作 2_ 丁酮酸前體的L-蘇氨酸，使得可以減少其它支鏈氨基酸的產(chǎn)生，并且可以持續(xù)地產(chǎn)生 L-異亮氨酸。在解決此問題的嘗試中，據(jù)報道，α-氨基-β_羥基正纈氨酸和L-蘇氨 酸衍生物可以用于增加 L-蘇氨酸的生產(chǎn)（Cayo Ramos等，Applied and environmental microbiology, (1992) 1677-1682)。進一步，報道了將L-異亮氨酸生產(chǎn)能力賦予至具有生 產(chǎn)L-蘇氨酸的能力的微生物的方法（韓國專利特開公布號2011-0058731)，同時至生產(chǎn) L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的微生物的方法（韓國專利特開公布號2002-0013777)等等。同 樣，據(jù)報道，4-硫雜異亮氨酸（thiaisoleucine)---種異亮氨酸衍生物的使用抑制了 蘇氨酸脫水酶的反饋（John J. Wasmuth, Journal of bacteriology, (1973) 562-570)。而 且，據(jù)報道，對異亮氨酸-異羥肟酸耐受的突變菌株具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強的能力 (M.Kisumi, Journal of general microbiology, (1971)69291-297)。另外，有 AHAS 的研究 與開發(fā)方法的報道，所述方法包括使產(chǎn)L-異亮氨酸菌株突變以與L-纈氨酸的生產(chǎn)相比增 加 L-異亮氨酸的生產(chǎn)（韓國專利特開公布號2011-0061780)，并且有集中于通過改變發(fā)酵 期間的氧供應或自然條件比如pH來增加 L-異亮氨酸的產(chǎn)量的研究的報道（Zhihian Peng 等，Bioprocess biosyst eng, (2010)33:339-345)。
[0005] 然而，至今已經(jīng)研究和開發(fā)的產(chǎn)L-異亮氨酸微生物對L-異亮氨酸生物合成途徑 中的一些物質(zhì)單獨地耐受。因而，仍存在開發(fā)對多種物質(zhì)耐受的產(chǎn)L-異亮氨酸微生物的需 要，所述物質(zhì)參與L-異亮氨酸生物合成中的反饋的控制。
[0006] 公開內(nèi)容
[0007] 技術問題
[0008] 本發(fā)明人已經(jīng)做了大量的努力來開發(fā)與現(xiàn)有菌株相比更好的產(chǎn)L-異亮氨酸微生 物，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對α-氨基-β-羥基正纈氨酸（L-蘇氨酸衍生物）、4_硫雜異亮氨酸和 異亮氨酸-異羥肟酸（異亮氨酸衍生物）耐受的突變菌株以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-異亮氨酸，從而 完成本發(fā)明。
[0009] 技術方案
[0010] 本發(fā)明的目的是提供以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌株。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供使用所述突變菌株生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法。
[0012] 本發(fā)明的仍另一個目的是提供從谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)生用于L-異亮氨酸的高產(chǎn)量 生產(chǎn)的突變菌株的方法。
[0013] 有益效果
[0014] 本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌突變菌株耐受L-異亮氨酸、L-蘇氨酸和它們的衍生物， 并且因而不經(jīng)受L-異亮氨酸的反饋抑制，并且被充分地供應為L-異亮氨酸的前體的L-蘇 氨酸。因而，它具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強的能力。因此，使用根據(jù)本發(fā)明的微生物生產(chǎn) L-異亮氨酸的方法可以高效率和高產(chǎn)量地生產(chǎn)L-異亮氨酸。
[0015] 附圖描述
[0016] 圖1顯示了包括本發(fā)明的最終產(chǎn)物一一L-異亮氨酸的支鏈氨基酸的生物合成途 徑。如圖1中所示，支鏈氨基酸使用相同的酶通過所述生物合成途徑生產(chǎn)。
[0017] 最佳實施方式
[0018] 在一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌突變菌株 KCCMl1248Ρ。
[0019] 如本文所使用，術語"L-異亮氨酸"指的是必需氨基酸中的一種和具有L-纈氨酸 和L-亮氨酸的支鏈氨基酸中的一種，并且具有HO 2CCH (NH2) CH (CH3) CH2CH3的結構式。
[0020] 如圖1中所示，在微生物中，從作為前體的丙酮酸和2- 丁酮酸通過4步生物合成 過程生物合成L-異亮氨酸。然而，所述生物合成步驟通常也用于其它支鏈氨基酸（即L-纈 氨酸和L-亮氨酸）的生物合成中，并且需要被充分地供應L-蘇氨酸--L-異亮氨酸生物 合成所需的前體。為此，通過發(fā)酵大量生產(chǎn)L-異亮氨酸是困難的。本發(fā)明的突變菌株耐受 最終產(chǎn)物L-異亮氨酸、L-蘇氨酸和它們的衍生物的反饋抑制，并且因而被充分地供應L-異 亮氨酸的前體。本發(fā)明的突變菌株是具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強能力的新型微生物。
[0021] 具體地，本發(fā)明的突變菌株可以耐受L-異亮氨酸或其衍生物和L-蘇氨酸或其衍 生物。更具體地，它可以耐受L-異亮氨酸衍生物和L-蘇氨酸衍生物。
[0022] 如本文所使用，術語"衍生物"指的是可以在最終產(chǎn)物L-異亮氨酸或其前體L-蘇 氨酸的生物合成中引起反饋抑制的已知化合物，所述反饋抑制可以減少L-異亮氨酸或 L-蘇氨酸的產(chǎn)生。L-異亮氨酸衍生物的實例包括但不限于4-硫雜異亮氨酸（thiaile)和 異亮氨酸-異羥肟酸（ileHx)，并且L-蘇氨酸衍生物的實例包括但不限于α -氨基-β -羥 基正纈氨酸（AHV)等等。具體地，突變菌株可以耐受選自4-硫雜異亮氨酸、異亮氨酸-異羥 肟酸和α-氨基-β-羥基正纈氨酸中的一種或多種。更具體地，突變菌株可以耐受4-硫 雜異亮氨酸、異亮氨酸-異羥肟酸和α -氨基-β -羥基正纈氨酸。
[0023] 眾所周知的是，當L-異亮氨酸累積超過特定的濃度或效價時，細胞中L-異亮氨酸 的生物合成被抑制。相應地，耐受衍生物的菌株解除由L-異亮氨酸引起的反饋抑制，并且 因而甚至在包含高濃度的L-異亮氨酸的條件下具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的能力。在本發(fā)明的 實例中，本發(fā)明人使用衍生物篩選生產(chǎn)高濃度的L-異亮氨酸的菌株。因為L-蘇氨酸被用 作生產(chǎn)L-異亮氨酸的2-丁酮酸的前體，耐受L-蘇氨酸的菌株解除由L-蘇氨酸引起的反 饋抑制，使得L-蘇氨酸充分地供應至其中。為此，L-蘇氨酸衍生物也用于篩選生產(chǎn)高濃度 的L-異亮氨酸的菌株。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，通過使親本菌株突變和篩選期望菌株而獲得具有生產(chǎn)L-異亮氨酸 的增強能力的突變菌株。在本文中，微生物的誘變可通過本領域廣泛已知的多種方法進行， 和使用物理或化學誘變方法中的一種進行。本發(fā)明中的化學誘變劑的實例包括但不限于 N-甲基-Ν' -硝基-N-亞硝基胍（NTG)、二乙氧基丁烷、乙基甲磺酸、芥子化合物（mustard compound)、肼、和亞硝酸鹽。物理誘變劑的實例包括但不限于紫外光和γ-福射。
[0025] 在誘變中，在適當濃度下誘變劑影響親本菌株，在該適當濃度下具有特定大小的 存活種群保留。所述大小可能不同，這取決于誘變劑的種類，并且所述大小取決于在存活種 群中的突變量，其由特定殺傷率下的突變劑引起。例如，當使用NTG時，可保留大約10-50% 的原始種群。當由亞硝酸鹽進行誘變時，可保留大約〇. 01-0. 1 %的原始種群，并且當由紫外 光進行誘變時，可保留大約I. 〇%的原始種群。在本發(fā)明的實例中，為了構建具有生產(chǎn)L-異 亮氨酸的增強能力的突變菌株，NTG被用于誘導親本菌株中的突變。
[0026] 在本發(fā)明的實例中，為了構建具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的增強能力的突變菌株，產(chǎn) 谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌KFCC 11040(谷氨酸棒狀桿菌KFCC 11040)(韓國專利特開公 布2000-0002407)被用作親本菌株。在親本菌株中進行隨機誘變后，親本菌株涂布在 補充L-異亮氨酸衍生物--比如4-硫雜異亮氨酸（thiaile)和異亮氨酸-異羥肟酸 (ileHx) 一一和L-蘇氨酸衍生物一一比如α -氨基-β -羥基正纈氨酸（AHV) -一的基本 培養(yǎng)基上。篩選分別耐受lmM、lmg/ml和25mg/ml的濃度下的所有衍生物的突變菌株并 命名為"KCJI-38"。另外，表明了突變菌株中L-異亮氨酸的產(chǎn)生至少比在親本菌株中高 13倍（見表1)。突變谷氨酸棒狀桿菌菌株（谷氨酸棒狀桿菌，KCJI-38)在2012年1月 9日以登錄號KCCM11248P保藏于國際保藏機構--韓國微生物保藏中心（地址=Yurim Building, 361-221，Hon