一種提取dna的方法和解離染色質(zhì)的方法以及高氯酸鹽的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地,涉及一種解離染色質(zhì)的方法、一種提取DNA的 方法和高氯酸鹽的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色質(zhì)是遺傳物質(zhì)的載體。染色質(zhì)是指間期細胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及 少量RNA組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu),是間期細胞遺傳物質(zhì)存在的形式。核小體是組成染色質(zhì)的 基本組成單位,由基因組DNA和5種組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4共同組成。2分子的H2A、 H2B、H3和H4共同構(gòu)成八聚體的核心組蛋白,DNA雙螺旋纏繞在這一核心上形成核小體的核 心顆粒。核心顆粒間由DNA和組蛋白Hl構(gòu)成的連接區(qū)而連接成串珠樣結(jié)構(gòu)。在哺乳動物基 因組DNA的提取環(huán)節(jié)中,無論是經(jīng)典提取方法(酚抽提法、異丙醇沉淀法和甲酰胺裂解法) 還是后期改良的方法,通常都是利用表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉(SDS)來裂解細胞,利 用蛋白酶K來降解核小體中的組蛋白,從而實現(xiàn)基因組DNA的分離。然而,由于利用蛋白酶 K對組蛋白進行酶解消化,經(jīng)典方法不僅需要加熱設(shè)備(如水浴鍋),而且增加了操作步驟, 環(huán)節(jié)繁瑣,實驗用時長。
[0003] 鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉和高氯酸鈉作為離液劑可以用于DNA的提取。如 CN1187196A公開了一種用于提取DNA的方法和裝置,涉及了鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉和高 氯酸鈉的使用,但是,上述離液劑在用于提取基因組DNA時,存在得率低的缺陷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有用于DNA的提取方法的得率低的缺陷,提供一種具有得 率高等優(yōu)勢的DNA提取方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的,一方面,本發(fā)明提供了一種解離染色質(zhì)的方法,該方法包括: 將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合;其中,所述解離劑含有高氯酸鋰。
[0006] 另一方面,本發(fā)明還提供了一種提取DNA的方法,所述DNA在提取前存在于染色質(zhì) 中;其中,該方法包括如下步驟:(1)將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合均勻,得到解離后 的物料;(2)將所述解離后的物料與蛋白抽提液混合均勻,分離得到蛋白抽提后的上清液; (3)將所述蛋白抽提后的上清液與DNA沉淀劑混合,得到DNA沉淀;其中,所述解離劑含有 高氯酸鋰。
[0007] 再一方面,本發(fā)明還提供了一種高氯酸鹽在提取DNA中的用途,所述DNA在提取前 存在于染色質(zhì)中,其中,所述高氯酸鹽為高氯酸鋰。
[0008] 通過上述技術(shù)方案,本發(fā)明以化學(xué)物質(zhì)高氯酸鋰(LiClO4)替代蛋白酶K來解離組 蛋白和基因組DNA,這種方法具有操作簡單、重復(fù)性好,穩(wěn)定性高的優(yōu)點,同時避免了蛋白酶 K法需要較高溫度(如50-65°C )加熱及長時間消化的劣勢。與傳統(tǒng)蛋白酶K消化法相比, 本發(fā)明能高效、快速、簡便地提取人類基因組DNA,且基因組完整性更好,可用于PCR、芯片 分析、分子克隆等分子生物學(xué)相關(guān)實驗。并且,與使用高氯酸鈉進行DNA提取的技術(shù)方案相 比,本發(fā)明具有得率高的優(yōu)勢。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0010] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解,并且構(gòu)成說明書的一部分,與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明,但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0011] 圖1是高氯酸鋰法(LiCKV法)和蛋白酶K法兩種基因組DNA提取方法提取臍帶 組織和臍帶間充質(zhì)干細胞基因組DNA的電泳檢測結(jié)果。
[0012] 圖2是高氯酸鋰法(LiCKV法)中利用不同的LiClO4終濃度所提取的臍帶間充質(zhì) 干細胞基因組DNA的電泳檢測結(jié)果。
[0013] 圖3是高氯酸鋰法(LiCKV法)和高氯酸鈉法(NaClO 4法)兩種基因組提取方法 的電泳檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是,此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。
[0015] -方面,本發(fā)明提供了一種解離染色質(zhì)的方法,該方法包括:將含有染色質(zhì)的樣品 與解離劑混合;其中,所述解離劑含有高氯酸鋰。
[0016] 其中,將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合后,高氯酸鋰的終濃度可以在較大范圍 內(nèi)變化,例如可以為〇· 1-3. 9mol/L,優(yōu)選為0· 25-3. 5mol/L,更優(yōu)選為2-3mol/L〇
[0017] 其中,優(yōu)選地,所述解離劑含有高氯酸鋰的水溶液。
[0018] 其中,優(yōu)選地,所述高氯酸鋰的水溶液中,高氯酸鋰的濃度只要高于高氯酸鋰的終 濃度即可,例如可以為不低于2mol/L且不高于飽和濃度,優(yōu)選為不低于4mol/L且不高于飽 和濃度。
[0019] 其中,作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,所述含有染色質(zhì)的樣品中含有裂解液;所 述裂解液含有表面活性劑。
[0020] 其中,所述表面活性劑包括但不限于吐溫-20、Triton X-100和NP40中的至少一 種。所述裂解液中,所述表面活性劑的濃度可以為〇. 1-10%體積比,優(yōu)選為〇. 5-5%體積 比。
[0021] 其中,所述裂解液中還含有平衡鹽、離子螯合劑和RNase A。所述平衡鹽包括但不 限于Tris-HCl和HEPES中的至少一種。所述離子螯合劑包括但不限于EDTA和檸檬酸鈉中 的至少一種。所述裂解液中,所述平衡鹽的濃度為10-100mm 〇l/L,優(yōu)選為30-70mmol/L ;所 述離子螯合劑的濃度為5-40mmol/L,優(yōu)選為10-30mmol/L ;RNase A的濃度為5-40 μ g/mL, 優(yōu)選為10-30 μ g/mL。所述裂解液的pH值可以為7. 5-8. 5。
[0022] 另一方面,本發(fā)明還提供了一種提取DNA的方法,所述DNA在提取前存在于染色質(zhì) 中;其中,該方法包括如下步驟:(1)將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合均勻,得到解離后 的物料;(2)將所述解離后的物料與蛋白抽提液混合均勻,分離得到蛋白抽提后的上清液; (3)將所述蛋白抽提后的上清液與DNA沉淀劑混合,得到DNA沉淀;其中,所述解離劑含有 高氯酸鋰。
[0023] 其中,將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合后,高氯酸鋰的終濃度可以在較大范圍 內(nèi)變化,例如可以為〇· 1-3. 9mol/L,優(yōu)選為0· 25-3. 5mol/L,更優(yōu)選為2-3mol/L〇
[0024] 其中,優(yōu)選地,所述解離劑含有高氯酸鋰的水溶液。
[0025] 其中,優(yōu)選地,所述高氯酸鋰的水溶液中,高氯酸鋰的濃度只要高于高氯酸鋰的終 濃度即可,例如可以為不低于2mol/L且不高于飽和濃度,優(yōu)選為不低于4mol/L且不高于飽 和濃度。
[0026] 其中,作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,該方法還包括:將含有染色質(zhì)的生物材料 與裂解液混合進行裂解,并且將裂解得到的裂解產(chǎn)物作為含有染色質(zhì)的樣本進行步驟(1) 的操作;所述裂解液含有表面活性劑
[0027] 其中,所述表面活性劑包括但不限于吐溫-20、Triton X-100和NP40中的至少一 種。所述裂解液中,所述表面活性劑的濃度可以為〇. 1-10%體積比,優(yōu)選為〇. 5-5%體積 比。其中,所述裂解液中還含有平衡鹽、離子螯合劑和RNase A。所述平衡鹽包括但不限于 Tris-HCl和HEPES中的至少一種。所述離子螯合劑包括但不限于EDTA和檸檬酸鈉中的至 少一種。所述裂解液中,所述平衡鹽的濃度為10-100mm 〇l/L,優(yōu)選為30-70mmol/L ;所述離 子螯合劑的濃度為5-40mmol/L,優(yōu)選為10-30mmol/L ;RNase A的濃度為5-40 μ g/mL,優(yōu)選 為10-30 μ g/mL。所述裂解液的pH值可以為7. 5-8. 5。
[0028] 其中,該方法還可以進一步包括:將原始生物材料進行預(yù)處理,以獲得適合直接用 于裂解的含有染色質(zhì)的生物材料。所述預(yù)處理的操作包括清洗、干燥、剪碎、研磨、冷凍和凍 融中的至少一種??梢园凑毡绢I(lǐng)域常規(guī)的方式進行預(yù)處理的操作,例如按照《分子克隆實驗 指南》中記載的內(nèi)容進行操作。
[0029] 其中,所述原始生物材料可以包括組織、器官、個體和共生體中的至少一種。所述 含有染色質(zhì)的生物材料可以包括血液、血細胞和人工培養(yǎng)細胞中的至少一種。
[0030] 其中,該方法還包括:將所述DNA沉淀進行洗滌和再溶解。其中,進行洗滌所用的 洗滌液可以為60-80體積%濃度的乙醇水溶液,進行再溶解所用的溶劑可以為水或TE緩沖 液。
[0031 ] 再一方面,本發(fā)明還提供了一種高氯酸鹽在提取DNA中的用途,所述DNA在提取前 存在于染色質(zhì)中,其中,所述高氯酸鹽為高氯酸鋰。
[0032] 以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0033] 實施例1 :
[0034] 本實施例用于說明從細胞樣品中提取DNA的操作。
[0035] (1)樣品預(yù)處理:以臍帶間充質(zhì)干細胞為例,將培養(yǎng)瓶中的臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng) PBS洗滌一次后,用胰酶消化,收集細胞懸液后,計數(shù),取約為2. 5 X IO5個細胞的懸液,1000 g 離心5min,棄上清,用ImL預(yù)冷的PBS重懸細胞并轉(zhuǎn)入I. 5mL EP管中,1000 g離心5min,棄 上清,用50 μ L TE緩沖液重懸細胞;
[0036] (2)分別采用高氯酸鋰法以及經(jīng)典的蛋白酶K法兩種方法提取:向步驟⑴的EP 管中加入500 μ L裂解液,充分混勻。其中高氯酸鋰法裂解液配方為:Tris-HCl (pH 8. 0) (50mmol/L)、EDTA(20mmol/L)、Tween-20(l% (v/v))、RNase A(20yg/mL);蛋白酶 K 法的裂 解配方為:Tris-HCl (pH 8· 0) (lOmmol/L)、EDTA(pH8. 0) (lOOmmol/L)、SDS(0. 5% (m/V));
[0037] (3)向步驟⑵的EP管中分別加入終濃度為3mol/L的蛋白變性劑LiClO4以及 100 μ g/mL蛋白酶K,振蕩混勻,其中加入蛋白酶K法需要在55°C放置2h,其余步驟相同;
[0038] (4)向步驟(3)的EP管中加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),振蕩混勻, 離心至溶液分層,將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中??芍貜?fù)本步驟一次,并用氯仿抽 提一次上清,將上清轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中;
[0039] (5)向步驟⑷的EP管中加入等體積的異丙醇,-20°C放置20min,離心收集基因 組 DNA ;
[0040] (6)向步驟(5)的EP管中加入ImL的70 %乙醇洗滌DNA,去上清,敞口晾干基因 組;
[0041] (7)向步驟(6)的EP管中加入100 μ L TE緩沖液,溶解基因組DNA沉淀。利用光 密度測定法測定基因組DNA的濃度,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。
[0042]