一種人類金屬硫蛋白-1融合蛋白表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種人類金屬硫蛋白-1融合蛋白表 達(dá)載體，尤其是涉及一種具有伴侶樣蛋白功能的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白與人類金屬硫蛋 白的融合表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學(xué)作用時(shí)，從動物器官分離出一種 新的蛋白質(zhì)，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質(zhì)稱為金屬硫蛋白（英文為 Metallothionein，簡稱 MT) 〇
[0003] 關(guān)于金屬硫蛋白，全球從1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美國共舉行了四 次國際專題研討會，第五次國際專題研討會于2005年10月在北京召開。1987年我國將MT 列入[863]計(jì)劃，"八五"、"九五"重大攻關(guān)項(xiàng)目，1994年列入國家級[火炬計(jì)劃];2003年 MT項(xiàng)目被國家科技部列為"國家科技成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃項(xiàng)目，1995年聯(lián)合國將MT列入向 世界各國推薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對MT的研究、開發(fā)、推廣、應(yīng)用的高 度重視。
[0004] 金屬硫蛋白（Metallothionein，MT),又稱疏基金屬結(jié)合蛋白。一類非酶蛋白質(zhì)， 除含有鎘（Cd)、鋅（Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅（Cu)、汞（Hz)、金（Au)、鉍（Bi)等 元素的MT。MT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生 解離的口!1值分別為 ：211-]\0':3.5~4.5;0(1-]\0':2.5~3.5;(：11-]\0'〈1.0。因]\0'缺乏芳香族 氨基酸，故在280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處 有一個(gè)吸收峰。所有脊椎動物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘 導(dǎo)產(chǎn)生的MT，其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。
[0005] 人類MT按分子特征和分布分為四個(gè)亞群：11'1、10'2、10'3、10'4。階1又分9個(gè)亞類， MT2又分MT2a和MT2b。MTl和MT2分布全身，MT3分布于腦，MT4主要分布于皮膚。
[0006] 自由基是人體衰老的第一大元兇，自由基還與人類若干中老年疾病緊密相關(guān)，導(dǎo) 致人體免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除劑，減少自由基就能延緩人體 衰老步伐。同時(shí)，MT也是目前唯一有效的重金屬解毒和清除蛋白。人體重金屬超標(biāo)或中毒， 損害肝、腎、骨、腦和記憶功能，引發(fā)多種疾病。
[0007] 大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、 治療或緩解消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、保護(hù)皮膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對 人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。
[0008] 目前MT產(chǎn)品主要從兔肝、馬腎、豬肝和微生物（如粗脈孢菌）等中提取，成本高、 產(chǎn)量低，抑制了她的廣泛使用，比如食品、飲品、化妝品等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體，所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載 體是將人類金屬硫蛋白1的編碼序列作為目標(biāo)蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白的融合蛋白 表達(dá)載體的多克隆區(qū)所得；所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體上游含有人類游離脂肪 酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列，人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭區(qū) 和用于插入目標(biāo)蛋白編碼序列的多克隆區(qū)。
[0012] 所述的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的同源性與人類天然游離脂肪酸結(jié)合蛋白的 同源性等于或大于85%。所述的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列優(yōu)選為經(jīng)過密碼 子優(yōu)化的編碼序列，所述的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列進(jìn)一步優(yōu)選如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 所述的柔性接頭區(qū)和多克隆區(qū)序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 所述的人類金屬硫蛋白-1其氨基酸序列優(yōu)選與人類天然金屬硫蛋白的氨基酸序 列的同源性等于或大于75%。
[0015] 人類金屬硫蛋白-1包括但不限于：人類金屬硫蛋白-la (MTla，氨基酸序列如SEQ ID NO. 21所示）、人類金屬硫蛋白-Ib (MTlb，氨基酸序列如SEQ ID NO. 22所示）、人類金屬 硫蛋白_e(MTle，氨基酸序列如SEQ ID NO. 23所示）、人類金屬硫蛋白-f (MTlf，氨基酸序列 如SEQ ID NO. 24所示）、人類金屬硫蛋白-g(MTlg，氨基酸序列如SEQ ID NO. 25所示）、人 類金屬硫蛋白_h(MTlh，氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示）、人類金屬硫蛋白-m(MTlm，氨 基酸序列如SEQ ID NO. 27所示）、人類金屬硫蛋白-r(MTlr，氨基酸序列如SEQ ID NO. 28 所示）、人類金屬硫蛋白-X (MTlx氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示）；優(yōu)選人類金屬硫蛋 白-Ib (MTlb，氨基酸序列如SEQ ID NO. 22所示）。
[0016] 人類金屬硫蛋白-Ib編碼序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 30所示。
[0017] 所述的表達(dá)載體中人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白_6的編碼序列的上游還包含編碼用 于分離純化融合蛋白的標(biāo)簽的序列，優(yōu)選編碼組氨酸標(biāo)簽的序列（SEQ ID NO. 4)。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體能夠促進(jìn)或誘導(dǎo)被融合的下游人類金屬硫蛋白融 合蛋白的折疊，具有蛋白伴侶樣蛋白的特性。
[0020] 2.該FABP蛋白為人源性，理論上不存在對人體的免疫原性，適于制藥工業(yè)中解 決目標(biāo)蛋白包涵體問題，并且可以保留融合蛋白一同治藥。
【附圖說明】
[0021] 圖UhFABP融合蛋白示意圖
[0022] 圖2、pET28a_hFABP6表達(dá)載體物理圖
[0023] 圖 3、pET28-hFABP6-MTlb 環(huán)狀質(zhì)粒物理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用進(jìn)行說明，所舉的實(shí)施例僅是對本發(fā)明的應(yīng) 用作概括性例示，有助于更好地理解本發(fā)明的用途，但并不會限制本發(fā)明應(yīng)用范圍。下述實(shí) 施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] -種伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0027] 步驟一、hFABP的編碼DNA的人工合成和優(yōu)化，本實(shí)施例以hFABP6為例：
[0028] (1)取hFBP6氨基酸序列（SEQ ID NO. 2)逆向翻譯成DNA編碼序列，經(jīng)過密碼子優(yōu) 先性、核糖體結(jié)合區(qū)序列優(yōu)化獲得序列（SEQ ID NO. 1)，但不限于此序列，以翻譯后的蛋白 質(zhì)氨基酸序列同源性等于或大于85%為限。
[0029] (2)將該編碼序列分段合成寡核苷酸單鏈DNA (SEQ ID NO. 5~18)。
[0030] (3)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)法合成全長編碼DNA序列，包含5' -6xHi sTag (SEQ ID NO. 4)、hFBP6氨基酸編碼序列、3' -柔性接頭序列（Linker)和多克隆區(qū)（SEQ ID NO. 3)。
[0031] (4)經(jīng)測序反應(yīng)驗(yàn)證全長DNA序列（SEQ ID NO. 19所示）。
[0032] 步驟二、載體制備：
[0033] (1)將步驟一合成得到的hFABP6全長編碼序列（SEQ ID NO. 19)，包含 5' -6xHisTag、3' -柔性接頭序列（Linker)和多克隆區(qū)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切消化、瓊脂糖 凝膠純化，獲得兩端分別是Nco I和Xho I的粘性接頭的插入片段。
[0034] (2)制備表達(dá)載體pET28a，但不限于該表達(dá)載體：
[0035] ①取pET28a載體1 μ g，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切。
[0036] ②瓊脂糖凝膠電泳分離、純化線性化后的pET28a載體。
[0037] ③用T4DNA連接酶將包含hFABP6序列的插入片段和步驟②制備好的pET28a表達(dá) 載體連接。
[0038] ④轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5 α，含卡那霉素（Kan)抗生素的培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜， 然后挑取單菌落，PCR法鑒定陽性克隆，常規(guī)制備DNA質(zhì)粒。
[0039] ⑤將陽性克隆質(zhì)粒送交DNA序列分析，選取和保留正確序列的克隆供表達(dá)測試。
[0040] ⑥載體命名為 pET28a-hFABP6(SEQ ID NO. 20)
[0041] 步驟三、載體的表達(dá)測試：
[0042] (1)將步驟二得到的p