一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物及其鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物及其鑒定方法，屬于分子標(biāo) 記技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis)是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，在我國廣泛分布 于南北沿海和各地湖泊，尤其是長江水系。中華絨螯蟹味道鮮美并且含有大量的維生素 A， 對兒童的佝僂病和老年人的骨質(zhì)疏松癥有很大的益處。
[0003] 隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化程度也隨著提高，就會產(chǎn)生近親繁殖和回交的現(xiàn) 象，近幾年中華絨螯蟹的品質(zhì)出現(xiàn)了嚴(yán)重退化的現(xiàn)象。在養(yǎng)殖對比試驗(yàn)的過程中，常常將不 同的家系放入同一池塘中養(yǎng)殖，最終也需要區(qū)分不同的中華絨螯蟹家系，因此建立一種中 華絨螯蟹的家系判定方法具有極其重要的理論和生產(chǎn)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物及其鑒定方法，有 助于快速準(zhǔn)確的鑒別不同家系的中華絨螯蟹，有效防止近親繁殖，在中華絨螯蟹的選育和 遺傳保護(hù)方面提供極大的理論依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物，該引物包括10對微衛(wèi)星引物，具體如 下：

[0008] 2. -種中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，包括以下步驟：
[0009] (1)從待鑒別的中華絨螯蟹腿部肌肉提取DNA ;
[0010] (2)以步驟⑴得到的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的10對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0011] (3)對步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物使用聚丙烯酰胺膠進(jìn)行電泳和銀染；
[0012] (4)對步驟（3)的銀染結(jié)果通過遺傳分析軟件進(jìn)行分析，測量每個個體之間的遺 傳距離，根據(jù)遺傳距離繪制UPGMA聚類分析圖，根據(jù)聚類結(jié)果區(qū)分不同中華絨螯蟹家系的 個體。
[0013] 所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，步驟（2)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系可以為 15ul:10XPCR Buffer 1.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5111，]\%(：121.5111，上下游引物各0.5111， Taq 酶 0· 2ul，DNA 模板 2ul，超純水 8. 3ul。
[0014] 所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，步驟（2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序可以為： 94°C預(yù)變性3分鐘；然后94°C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個循環(huán)；最 后72°C延伸10分鐘，4°C保存。
[0015] 所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，步驟（3)中PCR產(chǎn)物可以用12%的非變 性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳和銀染。
[0016] 所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，步驟（4)中所述的遺傳分析軟件可以為 population 軟件。
[0017] 本發(fā)明提供的鑒別中華絨螯蟹不同家系的分子標(biāo)記方法所用的引物，具有高度多 態(tài)性，進(jìn)一步保證了鑒別中華絨螯蟹不同家系的鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。
[0018] 本發(fā)明提供的鑒別中華絨螯蟹不同家系的分子標(biāo)記方法，可以將混雜的不同家系 的中華絨螯蟹的個體區(qū)別開來，有助于防止近親繁殖和選育。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例1中根據(jù)個體之間的遺傳距離畫出的UPGMA聚類分析圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 實(shí)施例1
[0021] (1)中華絨螯蟹的選?。?br>[0022] 選取4個抱卵的中華絨螯蟹雌蟹，待其子代長大，每只雌蟹的后代組成一個家 系，從第一個家系中選取21個個體，編號為1-21，從第二個家系中選取11個個體，編號為 22-32,從第三個家系中選取18個個體，編號為33-50,從第四個家系中選取18個個體，編號 為 51-68〇
[0023] (2)中華絨螯蟹親本和子代DNA的提?。?br>[0024] L從中華絨螯腿部取0· 2g肌肉，放入L 5ml離心管中，加入470ul SET。肌肉要 用研磨棒搗碎。
[0025] 2.加入25ul 20% SDS (終濃度為0· 5% )，然后加入5ul 20mg/ml蛋白酶K(終濃 度 200ug/ml)。
[0026] 3.放入55攝氏度水浴鍋水浴5小時看到溶液澄清。期間需要每一小時搖晃一下。
[0027] 4.加入Iu RNAse 37攝氏度水浴一小時。
[0028] 5.加入500毫升的飽和酚，上下顛倒半小時，顛倒過程中不能破壞DNA。
[0029] 6. 1000 Orpm 離心 10 分鐘。
[0030] 7.用槍頭吸出上清液，放入另一個干凈的離心管，槍頭的尖端要被減除，防止破壞 DNA。同時不要吸到下層的渾濁液體。
[0031] 8.重復(fù)5-7步驟。
[0032] 9.加入酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)，上下顛倒半小時，顛倒過程中不能破壞DNA。 在離心機(jī)上1000 Orpm離心10分鐘。用槍頭吸出上清液，放入另一個干凈的離心管，槍頭的 尖端要被減除，防止破壞DNA。同時不要吸到下層的渾濁液體。
[0033] 10.加入氯仿：異戊醇（24:1)，上下顛倒半小時，顛倒過程中不能破壞DNA。在離 心機(jī)上1000 Orpm離心10分鐘。用槍頭吸出上清液，放入另一個干凈的離心管，槍頭的尖端 要被減除，防止破壞DNA。同時不要吸到下層的渾濁液體。
[0034] 11.在上清液中加入1ml的預(yù)冷的無水乙醇，用力快速旋轉(zhuǎn)，直至析出白色沉淀， 或者在零下20攝氏度冰箱中過夜。
[0035] 12.在離心機(jī)1000 Orpm旋轉(zhuǎn)3分鐘，棄上清液，剩下固體，加入1ml的70%的乙醇 洗滌沉淀。
[0036] 13.在離心機(jī)上1000 Orpm旋轉(zhuǎn)三分鐘，棄掉上清液，此時DNA沉淀與壁粘附不牢， 容易隨乙醇滑出?；厥誅NA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽。
[0037] 14. 40-50攝氏度烘干，加入適量的超純水。
[0038] (3)中華絨螯蟹PCR產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)和電泳檢測
[0039] 本實(shí)驗(yàn)所選用的10對微衛(wèi)星引物及條件如表1所示，PCR反應(yīng)體系為15ul : 10XPCR BufTerl.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，MgCl2L 5ul，上下游引物各 0.5ul，Taq 酶 0. 2ul，DNA模板2ul，超純水8. 3ul。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘；然后94°C變性30秒， 62°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。
[0040] PCR產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染后拍照。
[0041] 表1中華絨螯蟹10對微衛(wèi)星引物的基本信息

[0044] (4)遺傳結(jié)構(gòu)分析
[0045] 將步驟（3)得到的10對微衛(wèi)星清晰的電泳圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，通過Cervus軟 件計(jì)算出這10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量（表2)。
[0046] 表2中華絨螯蟹10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量
[0048] 由表2可以看出每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)介于3. 5和5. 7之間，大部分位點(diǎn)的 觀測雜合度在〇. 5附近，所有位點(diǎn)的多態(tài)信息含量均大于0. 5,均表現(xiàn)為高度多態(tài)性。通過 軟件population軟件分析計(jì)算每個個體之間的遺傳距離，并構(gòu)建UPGMA聚類分析圖，結(jié)果 如圖1所示，四個中華絨螯蟹家系聚類成4個大的分支，同一個家系所有的個體聚類在同 一個大的分支上，可以確定他們的親緣關(guān)系，這與前提條件完全相同；不同家系的個體聚類 在不同的分支上，說明它們親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，也和前提條件完全相同，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到了 100%。根據(jù)聚類圖表現(xiàn)出的親緣關(guān)系，可以區(qū)分4個家系，從而驗(yàn)證了這個方法的可靠性。 我們得出結(jié)論，分布在不同大的分枝上的個體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。所以我們可以用這10個微衛(wèi) 星位點(diǎn)和這個方法來區(qū)分不同的中華絨螯蟹家系。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物，其特征在于，該引物包括10對微衛(wèi)星引 物，具體如下：2. -種中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 從待鑒別的中華絨螯蟹腿部肌肉提取DNA; (2) 以步驟⑴得到的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的10對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 擴(kuò)增產(chǎn)物； (3) 對步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物使用聚丙烯酰胺膠進(jìn)行電泳和銀染； (4) 對步驟（3)的銀染結(jié)果通過遺傳分析軟件進(jìn)行分析，測量每個個體之間的遺傳距 離，根據(jù)遺傳距離繪制UPGMA聚類分析圖，根據(jù)聚類結(jié)果區(qū)分不同中華絨螯蟹家系的個體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，其特征在于，步驟（2) 中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 15ul:10XPCRBuffer1.5ul，2.5mmol/LdNTP0.5ul，MgCl2 1. 5ul，上下游引物各0. 5ul，Taq酶0. 2ul，DNA模板2ul，超純水8. 3ul。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，其特征在于，步驟（2)中 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘；然后94°C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸 30秒，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，其特征在于，步驟（3)中 PCR產(chǎn)物用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳和銀染。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華絨螯蟹不同家系的鑒定方法，其特征在于，步驟（4)中所 述的遺傳分析軟件為population軟件。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定中華絨螯蟹不同家系所用的引物及其鑒定方法，包括以下步驟：采集待鑒別的中華絨螯蟹的樣本；從中華絨螯蟹腿部肌肉提取DNA；以提取出來的DNA為模板，用10對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，然后進(jìn)行銀染；對銀染結(jié)果進(jìn)行數(shù)字化分析，用遺傳軟件測量個體之間的遺傳距離，根據(jù)遺傳距離繪制UPGMA聚類分析圖，根據(jù)聚類分析結(jié)果區(qū)分不同家系的個體。本發(fā)明可以快速準(zhǔn)確的對中華絨螯蟹的家系進(jìn)行區(qū)分，有效防止近親繁殖，在中華絨螯蟹家系選育和育種中有很大的應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105385767
【申請?zhí)枴緾N201510955048
【發(fā)明人】沈懷舜, 胡亞成, 馬源潮, 周鑫
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月17日