尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物的應(yīng)用及制備的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種尿液外泌體microRNA分子標(biāo) 志物在制備狼瘡性腎炎活動(dòng)性評(píng)估制劑方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 紅斑狼瘡(LE)是一種經(jīng)典的自身免疫性疾病。此病不僅可以累及皮膚，也可累及 其他器官和系統(tǒng)。多器官、多系統(tǒng)受累的紅斑狼瘡稱之為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。系統(tǒng)性紅 斑狼瘡是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性復(fù)雜性疾病。狼瘡性腎炎(LN)是SLE最常見和最嚴(yán) 重的內(nèi)臟損害，也是SLE預(yù)后不良的主要原因。在疾病初期，有尿檢或者腎功能異常者占 25%~50%，而腎活檢顯示幾乎所有SLE患者均有不同程度的腎損害。LN是我國最常見的繼 發(fā)性腎小球疾病之一，常反復(fù)發(fā)作，約20%在10年內(nèi)發(fā)展為尿毒癥。紅斑狼瘡治療的目的在 于控制病情，減緩疾病進(jìn)展，保持病情長(zhǎng)期緩解與穩(wěn)定，防治重要器官損害。特別強(qiáng)調(diào)早期 診斷和早期治療，以避免或延緩不可逆轉(zhuǎn)的組織器官損害。
[0003] 外泌體（exosome)是一些小的、分泌的、由膜包裹的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，直徑通常小于 100nm，以30-50nm為主。自1987年在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞變成成熟的紅細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn)外泌體的 分泌以來，相繼又在其他一些哺乳動(dòng)物如豬、鼠、兔等的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。外泌體可以由B淋巴細(xì) 胞、樹突狀細(xì)胞、血小板、腫瘤細(xì)胞系、肥大細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等各種細(xì) 胞分泌，并具有體內(nèi)抗原遞呈、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、傳遞成形素、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡、胞間膜 交換、免疫治療、免疫調(diào)控的作用。外泌體幾乎存在于所有的體液中，如人的支氣管肺泡灌 洗液、惡性胸腔積液、血漿、尿液、乳汁、羊水、腹水、唾液、腦脊液、膽汁、精液等。近些年，基 于外泌體尋找疾病的相關(guān)生物標(biāo)志物引起了研究人員廣泛的關(guān)注，特別是自2007年發(fā)現(xiàn)外 泌體包含豐富的小RNA，尤其是microRNA之后，以外泌體microRNA為基礎(chǔ)篩查疾病的相關(guān)生 物標(biāo)志物得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。microRNA是一些小的非編碼RNA，長(zhǎng)度通常為21個(gè)堿基，它們 以其靶向針對(duì)信使RNA 3'非翻譯區(qū)來抑制翻譯和即使有大量核酶存在也依然穩(wěn)定存在于 各種體液中而被廣泛用做生物標(biāo)志物。本發(fā)明的目的即是首次發(fā)現(xiàn)了某些尿液外泌體 mi croRNA可以作為篩查狼瘡性腎炎活動(dòng)性相關(guān)的生物標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物在制備狼瘡性腎炎活 動(dòng)性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，以及制備的試劑盒。
[0005] 尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物在制備狼瘡性腎炎活動(dòng)性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用， 所述的尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物是hsa-miR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一種或兩 種；
[0006] 所述 hsa-miR-1202 的序列是:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG;
[0007] 所述 hsa-miR-1207-5p 的序列是：UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG。
[0008] 所述的狼瘡性腎炎活動(dòng)性檢測(cè)試劑盒為用于定量檢測(cè)尿液外泌體microRNA分子 標(biāo)志物hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中的一種或兩種的試劑盒。具體是為實(shí)時(shí)熒光定 量PCR檢測(cè)試劑盒。
[0009] -種具有狼瘡性腎炎活動(dòng)性檢測(cè)能力的試劑盒，包括尿液外泌體提取系統(tǒng)、外泌 體總RNA提取系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)和相對(duì)定量?jī)?nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng);所述的試劑盒是通 過定量檢測(cè)尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物hsa-miR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一種或 兩種來判斷狼瘡性腎炎的活動(dòng)性;所述hsa-miR-1202的序列是:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG; 所述hsa-miR-1207-5p的序列是:UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG。所述的相對(duì)定量?jī)?nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化系 統(tǒng)由hsa-miR-16組成。
[0010] 所述尿液外泌體提取系統(tǒng)包括40%PEG6000(聚乙二醇6000);
[0011 ] 所述外泌體總RNA提取系統(tǒng)包括2 X Denaturing Solution(2 X變性液）、Acid-Phenol CHCl3(酸氯仿）、miRNA Wash Solution l(miRNA清洗液l)、Wash Solution 2/3(清 洗液2/3)、RNase_free ddH2〇(無酶水）；
[0012] 所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括5XRT primer(5X反轉(zhuǎn)錄引物）和dNTP Mix(dNTP混合物）、 Reverse transcriptase(反轉(zhuǎn)錄酶）、10XRT Buffer(10X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液）、RNase Inhibiter(RNA酶抑制劑）、RNase_free ddH2〇(無酶水）；
[0013] 所述擴(kuò)增系統(tǒng)包括2XMaster Mix(2X預(yù)混液）和20XTM probe(20XTM探針）、 RNase-free ddH2〇〇
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0015] 首先，本發(fā)明所提供的尿液外泌體microRNA分子標(biāo)志物包括hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p中任意一個(gè)或兩個(gè)，這些分子標(biāo)志物都能夠單獨(dú)或者結(jié)合起來用于檢測(cè)狼瘡 性腎炎活動(dòng)性。具體是用于制備狼瘡性腎炎活動(dòng)性檢測(cè)試劑盒，該試劑盒通過定量檢測(cè)尿 液外泌體microRNA分子標(biāo)志物hsaniR-1202和hsa-miR-1207_5p中的一種或兩種來篩查和 判斷狼瘡性腎炎的活動(dòng)性。其次，由于尿液具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)體外檢測(cè)的 優(yōu)點(diǎn)，因此從尿液中尋找生物標(biāo)志物可以將狼瘡性腎炎活動(dòng)性的早期篩查和診斷提高至一 個(gè)新的水平；同時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)狼瘡性腎炎尿液外泌體microRNA水平的檢 測(cè)，定量準(zhǔn)確，相對(duì)于芯片技術(shù)、分子雜交技術(shù)或者高通量測(cè)序技術(shù)，該方法簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì) 實(shí)用且便于臨床開展。
[0016] 以下結(jié)合【附圖說明】和【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步詳細(xì)的解釋和說明本發(fā)明，而不會(huì)限制 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】：
[0017] 圖1是用透射電鏡的方法鑒定所提取的尿液外泌體；
[0018] 圖2是用Agilent 2100生物分析儀分析尿液外泌體所提取總RNA大??；
[0019] 圖3是用Agilent microRNA芯片分析尿液外泌體所提取總RNA中microRNA種類，其 中RA1、RA2、RA3為活動(dòng)性狼瘡性腎炎，non-RAl、non-RA2、non-RA3為非活動(dòng)性狼瘡性腎炎， HC1、HC2、HC3為健康對(duì)照；
[0020] 圖4a是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1202在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、非活動(dòng)性狼瘡性腎 炎、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中經(jīng)RT-qPCR相對(duì)定量分析圖；
[0021] 圖4b是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1207-5p在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、非活動(dòng)性狼瘡性 腎炎、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中經(jīng)RT-qPCR相對(duì)定量分析圖；
[0022]圖4c是本發(fā)明所提供的相對(duì)定量?jī)?nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)hsa-miR-16在活動(dòng)性狼瘡性腎 炎、非活動(dòng)性狼瘡性腎炎、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中經(jīng)RT-qPCR采用原始Ct值的分析圖； [0023]圖5a是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1202在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、非活動(dòng)性狼瘡性腎炎 尿液外泌體樣本中R0C診斷分析圖；
[0024]曲線下的面積
[0025] 檢驗(yàn)結(jié)果變量:以miR16為內(nèi)參的相對(duì)定量
[0026]
[0027]
[0028]檢驗(yàn)結(jié)果變量以miR16為內(nèi)參的相對(duì)定量至少有一個(gè)在正實(shí)際狀態(tài)組和負(fù)實(shí)際狀 態(tài)組之間的結(jié)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可能有偏差。
[0029] a.按非參數(shù)假設(shè)
[0030] b.原假設(shè):真實(shí)面積= 0.5;
[0031]圖5b是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1207-5p在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、非活動(dòng)性 [0032]狼瘡性腎炎尿液外泌體樣本中R0C分析圖；
[0033]曲線下的面積
[0034] 檢驗(yàn)結(jié)果變量:以miR16為內(nèi)參的相對(duì)定量
[0035]
[0036]檢驗(yàn)結(jié)果變量以miR16為內(nèi)參的相對(duì)定量至少有一個(gè)在正實(shí)際狀態(tài)組和負(fù)實(shí)際狀 態(tài)組之間的結(jié)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可能有偏差。
[0037] a.按非參數(shù)假設(shè)
[0038] b.原假設(shè):真實(shí)面積= 0.5;
[0039] 圖6a是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、 非活動(dòng)性狼瘡性腎炎、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中經(jīng)RT-qPCR相對(duì)定量后的Spearman相關(guān) 性分析圖，由圖可見，經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理后的兩個(gè)microRNA的表達(dá)量具有很強(qiáng)的相關(guān)性，相 關(guān)系數(shù)高達(dá)0.976，P<0.001，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著；
[0040] 圖6b是本發(fā)明所提供的hsa-miR-1202和hsa-miR-1207-5p在活動(dòng)性狼瘡性腎炎、 非活動(dòng)性狼瘡性腎炎、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中經(jīng)RT-qPCR采用原始Ct值的Spearman相 關(guān)性分析圖，由圖可見，未經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的兩個(gè)microRNA的表達(dá)量一樣具有很強(qiáng)的相關(guān) 性，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.971，P<0.001，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
【具體實(shí)施方式】：
[0041 ]實(shí)施例1:檢測(cè)活動(dòng)性狼瘡性腎炎尿液外泌體樣本、非活動(dòng)性狼瘡性腎炎尿液外泌 體樣本、健康對(duì)照尿液外泌體樣本中mi croRNA的表達(dá)。
[0042]實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)試劑：
[0043]本發(fā)明中使用系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎臟活躍病人晨尿樣本41例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡非腎 臟活躍病人晨尿樣本37例、健康對(duì)照晨尿樣本45例。所有樣本均為除了系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?無其他自身免疫性疾病、除了狼瘡性腎炎外無其他腎臟疾病、無尿路感染以及近期無其他 重大疾病。其中腎臟是否活躍以SLEDAI-2K評(píng)分系統(tǒng)中蛋白尿、血尿、白細(xì)胞尿、管型尿四項(xiàng) 打分為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。若蛋白尿>〇.5g/24h，則僅此一項(xiàng)即可判斷為腎臟活躍；若蛋白尿< 0.5g/24h，則其他三項(xiàng)需滿足兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上才可判斷為腎臟活躍。
[0044] 實(shí)驗(yàn)試劑均為常用的分子生物學(xué)試劑，主要有PEG6000 (聚乙二醇6000，Catalog# 528877)購自Merck Millipore，mirVana PARIS mirVana Protein And RNA Isolation System(Catalog#AMl 556，Amb ion)試劑盒，無水乙醇為分析純，Taqman mi croRNA assay、 TaqMan Mi croRNA Reverse Transcription Kit(Catalog#4366596,Applied Biosystems)、Taqman Universal Master Mix II，no UNG(Catalog#4440040，Applied Biosystems)均購自Applied Biosystems公司。
[0045] 實(shí)驗(yàn)過程：
[0046] 1、尿液樣本的處理
[0047] 取新鮮晨尿，2000g，室溫離心20min，分離上清和沉淀，上清中加入0.5M EDTA使其 終濃度為20mM以抑制各種蛋白酶活性，可直接提取外泌體或者凍存于-80°C直至外泌體提 取時(shí)于37°C水浴徹底融化并再次2000g，室溫離心10min以去除因凍融形成的蛋白沉淀。 [0048] 2、外泌體的提取
[0049] 于15mL離心管中吸入5mL尿液上清、5mL 40%PEG6000并徹底混勻，4°C放置過夜。 然后將10mL尿液與PEG6000的混合物分裝于6個(gè)1.5mL Ep管，10000g，4°C離心60min，棄上 清，用200yL PBS重懸外泌體并收集到一個(gè)1.5mL Ep管中。
[0050] 3、外泌體總RNA的提取
[0051 ] 所有尿液外泌體總RNA的提取均按照mirVana PARIS mirVana Protein And RNA Isolation System(Catalog#AMl556，Ambion)試劑盒所提供的操作步驟，并用Nanodrop定 量，然后凍存于_80°C冰箱，直至檢測(cè)。
[0052] 4、cDNA 的合成
[0053] 取20ng RNA，其余操作均按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Catalog#4366596，Applied Biosystems)所提供的步驟進(jìn)行。加入3yL 5XRT primer，1.5 yL lOXReverse Transcription Buf f er, 0.15yL dNTPs (lOOmM), lyL MultiScribe Rev