一種雞tgfbr2基因甲基化檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了 一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞腸炎沙門氏菌病是家禽生產(chǎn)中的常見疾病，腸炎沙門氏菌能夠透過(guò)蛋殼進(jìn)入雞 蛋產(chǎn)品中，且能在生殖道中寄存繁殖。之前有報(bào)道，美洲等發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)生的食物中毒事 件，大多數(shù)是由禽類的沙門氏菌而引起的，而其中，起主要作用的病原就是腸炎沙門氏菌。 腸炎沙門氏菌對(duì)家禽生產(chǎn)造成重大影響，引起畜禽發(fā)病，而且是食源性致病菌，能通過(guò)家禽 副產(chǎn)品給人類的健康帶來(lái)很大的威脅，是報(bào)道最頻繁的致病微生物之一;表觀遺傳修飾尤 其是基因的甲基化在在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、腫瘤癌癥及相關(guān)疾病發(fā)生 中起著重要調(diào)控作用，而基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化能夠通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)影響各種疾病 的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。
[0003] 甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要模式，TGFBR2基因可通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化而 喪失活性，在多種疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮表達(dá)調(diào)控作用；目前尚沒(méi)有關(guān)于雞TGFBR2基因甲基 化檢測(cè)方法，以及TGFBR2基因在雞腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮的甲基化調(diào)控作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長(zhǎng)期研究和探索，提供了一種雞 TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)的特異性引 物及配合該引物使用的巢式PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)雞感染腸炎沙門 氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情況，并可以以此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提 供理論依據(jù)。
[0005] 發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
[0006] 一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞TGFBR2 基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0007]
[0008] 上述引物前一對(duì)為第一對(duì)引物，后一對(duì)為第二對(duì)引物，利用上述2對(duì)特異性引物對(duì) 經(jīng)亞硫酸鹽對(duì)修飾處理后的雞的全基因組基因 DNA進(jìn)行巢式PCR，2次反應(yīng)條件一致，其PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系如下，每20yL體系為：
[0009]
[0010]
[0011] PCR擴(kuò)增條件為：
[0012]
[0013] 其中所述的亞硫酸鹽修飾處理采用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對(duì)雞基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn)因5^ 甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā)生變化。
[0014] 而上述的PCR擴(kuò)增條件也根據(jù)本發(fā)明的目的進(jìn)行了對(duì)應(yīng)調(diào)整，是在眾多備選條件 中優(yōu)選出的最佳條件，可配合本發(fā)明的特異性引物起到最佳的檢測(cè)效果。
[0015] 所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示， 腸炎沙門氏菌感染后TGFBR2基因中所檢測(cè)各CpG位點(diǎn)的甲基化受到激活，利用這一特性，可 以作為腸炎沙門氏菌感染的甲基化分子標(biāo)記。
[0016] 基于上述理由，利用本發(fā)明所述的雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法檢測(cè)待測(cè)雞群， 可以作為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供可靠的依據(jù)，并將其應(yīng)用與養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了 一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法及其應(yīng) 用，該方法提供了雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)的特異性引物及配合該引物使用的巢式PCR條 件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)雞感染腸炎沙門氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情 況，并可以以此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下述實(shí)施例中除特殊說(shuō)明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞TGFBR2 基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0021]
[0022]選擇腸炎沙門氏菌陰性的壽光雞6-10只，試驗(yàn)組口服接種含菌量為109cfu的腸炎 沙門氏菌菌液0.3mL，對(duì)照組接種0.3mL PBS緩沖液，接種后14日采集盲腸樣品，提取基因組 DNA，試驗(yàn)組和對(duì)照組各取3-5只。
[0023]用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對(duì)雞基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā) 生甲基化的胞嘧啶位置轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn)因甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā) 生變化。
[0024] 上述引物前一對(duì)為第一對(duì)引物，后一對(duì)為第二對(duì)引物，利用上述2對(duì)特異性引物對(duì) 上述經(jīng)亞硫酸鹽對(duì)修飾處理后的雞的全基因組基因 DNA進(jìn)行巢式PCR，2次反應(yīng)條件一致，其 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下，每20yL體系為：
[0025]
[0026]
[0027]
[0028]
[0029] 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行，測(cè)序檢測(cè)發(fā)生甲基化的CpG位 點(diǎn)數(shù)量，測(cè)序結(jié)果顯示TGFBR2基因發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)數(shù)量如下表：
[0030] TGFBR2基因發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)數(shù)量
[0031]
[0032]結(jié)果顯示對(duì)照組發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)的個(gè)數(shù)為130個(gè)，試驗(yàn)組為134個(gè)，試驗(yàn)組多 于對(duì)照組。進(jìn)一步比較每一個(gè)CpG位點(diǎn)在對(duì)照組與處理組中發(fā)生甲基化的百分比情況，結(jié)果 如下表所示，在檢測(cè)到的5個(gè)CpG位點(diǎn)中，受腸炎沙門氏菌的影響，只有在CpG5位點(diǎn)甲基化受 到抑制，其余4個(gè)CpG位點(diǎn)均表現(xiàn)為甲基化水平升高。
[0033] 對(duì)照組與處理組甲基化CpG位點(diǎn)百分比 [0034]
[0035]可見腸炎沙門氏菌感染后TGFBR2基因中所檢測(cè)各CpG位點(diǎn)的甲基化受到激活，因 此可以作為腸炎沙門氏菌感染的甲基化分子標(biāo)記，為雞抗腸炎沙門氏菌感染的遺傳選育提 供理論依據(jù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法，其特征在于:所采用的方法為巢式PCR，所采用 的雞TGFBR2基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：上述引物前一對(duì)為第一對(duì)引物，后一對(duì)為第二對(duì)引物，利用上述2對(duì)特異性引物對(duì)經(jīng)亞 硫酸鹽修飾處理后的雞的全基因組基因DNA進(jìn)行巢式PCR，兩次反應(yīng)條件一致，其PCR擴(kuò)增反 應(yīng)體系如下，每20yL體系為：PCR擴(kuò)增條件為：所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌克隆，轉(zhuǎn)化成功后直接進(jìn)行測(cè)序，以確定甲基化是否 受到激活； 其中所述的亞硫酸鹽修飾處理采用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對(duì)雞基因組DNA進(jìn)行 亞硫酸鹽修飾處理，使未發(fā)生甲基化的胞嘧啶位置轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而發(fā)生甲基化位點(diǎn)因5^ 甲基胞嘧啶的保護(hù)而不發(fā)生變化。2. 權(quán)利要求1所述的雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法在雞抗腸炎沙門氏菌感染中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞TGFBR2基因甲基化檢測(cè)的特異性引物及配合該引物使用的巢式PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)雞感染腸炎沙門氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情況，并可以以此作為分子標(biāo)記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105483263
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610016805
【發(fā)明人】李顯耀, 王莎莎, 王巧巧
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月11日