解脂亞羅酵母及利用其生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種解脂亞羅酵母，還涉及一種利用該解脂亞羅酵母發(fā)酵制取γ -癸內(nèi)酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ -癸內(nèi)酯(γ _Decalactone，GDL)是一種內(nèi)酯類香味物質(zhì)，它是一個含有五元內(nèi)酯環(huán)的十碳化合物，分子式為CiqH18O2,分子量為170.25 ADL為無色液體，呈椰子、桃子、柑橘、椰子香氣，沸點(diǎn) 153°C/2000Pa 或 114-116°C/66.7Pa，折射率(nD21.5)1.4610，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。被廣泛用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等型香精中，是香料中需求較大的產(chǎn)品之一。GDL天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒、朗姆酒中，具有醋香、果香、奶油香、桃子、椰子香，也存在于乳制品的風(fēng)味物質(zhì)中，是調(diào)配桃子、杏、漿果、奶油、柑橘、椰子、巧克力、奶制品等食用香精的常用原料。
[0003]1969年，GDL被美國食品藥品管理局認(rèn)為是安全的食品添加劑和藥物添加劑我國GB2760-86規(guī)定為允許使用的食用香料。它以其誘人的桃香和低香氣閾值(水中為0.088mg/L)的特性而得以在香料工業(yè)中普遍應(yīng)用。GDL廣泛用于各類花香、果香、東方香型、檀香型日化香精，有良好定香作用;也可用于食品、煙用、飼料、酒用香精中。
[0004]很多香料公司將興趣投向了這一潛在市場并開始進(jìn)行研發(fā)，使得GDL的生產(chǎn)有了快速發(fā)展，天然⑶L的售價也由20000美元/kg降至1000美元/kg(2014年)。但目前市場上銷售的GDL仍主要是由化學(xué)合成的無旋光活性的外消旋混合物，如日本SODA公司以及國內(nèi)一些香料公司均有化學(xué)合成的GDL出售。化學(xué)法合成GDL主要由辛醛與丙二酸縮合，再脫羧和環(huán)化而成。普通條件下利用有機(jī)合成的GDL是無旋光的外消旋混合物，而用微生物法生產(chǎn)則可以得到具有旋光活性和相對較純的產(chǎn)物，且可以一次完成由化學(xué)合成需要許多步驟的生產(chǎn)過程，具有很高的實(shí)用價值。
[0005]目前，GDL主要利用化學(xué)合成法制備，如:新醛和丙二酸合成法該法由辛醛與丙二酸縮合，再脫梭、環(huán)化而得GDL。由于原料易得，反應(yīng)路徑短，產(chǎn)率高，是工業(yè)上常用方法。還有糠酸法，糠酵是一種常見易得原料，目前己幵發(fā)出將糠酵用格氏反應(yīng)在支鏈上引入烷基，再開環(huán)為γ -酮酸，脫水內(nèi)酯化而得⑶Lc3Reformat sky反應(yīng)合成法一輕基化合物與β-鹵代酯在鋅存在下縮合為羥基酸酯，再山酸催化脫水得GDL。由于庚醛可由蓖麻油裂解而得，因此有充足的原料來源，但有機(jī)鋅試劑必須在惰性溶劑中反應(yīng)，仍不是很廣。醇類與不飽和酸酯游離基加成反應(yīng)合成法，醇在游離基引發(fā)劑引發(fā)下形成游離基，其與不飽和羧酸酯進(jìn)行加成可生成GDL。常用游離基引發(fā)劑是二叔丁基過氧化物。a-烯烴法用價廉的辛醇脫水可以制得辛醇，辛醇可以一步合成GDL，合成方法簡便，是一種正在開發(fā)的工業(yè)合成方法。由此可知，利用化學(xué)合成法生產(chǎn)GDL都涉及有機(jī)溶劑的應(yīng)用，不可避免帶來有機(jī)溶劑的殘留，產(chǎn)品安全性方面存在問題。
[0006]國內(nèi)生物發(fā)酵法制備GDL研究大都停留在發(fā)酵工藝優(yōu)化及菌株篩選層面，對GDL產(chǎn)生的工業(yè)法發(fā)酵機(jī)理研究甚少，這是制約生物發(fā)酵法生產(chǎn)⑶L產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為此，本發(fā)明的目的之一是提供一種解脂亞羅酵母Yarrowia Lipolytica C85#。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供一種利用解脂亞羅酵母生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的方法。
[0009]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0010]一種解脂亞羅酵母Yarrowia Lipolytica C85#，所述解脂亞羅酵母YarrowiaLipolytica C85#被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為:CGMCC N0.11736，保藏時間為:2015年11月25日。
[0011]一種利用所述的解脂亞羅酵母生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的方法，將所述的解脂亞羅酵母發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯。
[0012]優(yōu)選的是，所述的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25°C_27°C，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為 280-288h。
[0013]優(yōu)選的是，所述的方法中，在發(fā)酵培養(yǎng)中，于培養(yǎng)開始后的64h、76h、92h和102h分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中按照質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)補(bǔ)加3%_4%的葡萄糖和2%-7%的蓖麻甲醇酸甲酯。
[0014]優(yōu)選的是，所述的方法中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)中，初始攪拌速度為45-50rpm，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧低于30 %后，首先按照0.2vvm、0.3vvm和0.4vvm的順序每隔一定時間調(diào)整空氣流量，然后按照0.03MPa、0.04MPa和0.05MPa的順序每隔一定時間調(diào)整壓力，最后按照50rpm、60rpm和70rpm的順序每隔一定時間調(diào)整攪拌速度。
[0015]優(yōu)選的是，所述的方法中，所述一定時間為5?lOmin。
[0016]優(yōu)選的是，所述的方法中，培養(yǎng)過程中，在產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯之后還包括采用超臨界CO2方法萃取Y-癸內(nèi)酯。
[0017]優(yōu)選的是，所述的方法中，所述超臨界CO2方法中采取的溫度為30_40°C，壓力為10-15MPa，時間為 I.5-3.0h。
[0018]優(yōu)選的是，所述的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含:葡萄糖30_40g/L，玉米漿50_60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐溫-80 8-10g/L，硫酸銨10_12g/L，硫酸鎂2.4-3.2g/L，磷酸鈉1.2-2.8g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.8g/L，VB2 5_10mg/kg和硫酸鐵20_30mg/L。
[0019]本發(fā)明制備的γ-癸內(nèi)酯是經(jīng)紫外、NTG誘變出解脂亞羅酵母(YarrowiaLipolytica)生物發(fā)酵得到，以蓖麻甲醇酸甲酯作為前體，采用間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵，選擇了更適宜液體培養(yǎng)基配方及相應(yīng)的發(fā)酵控制參數(shù)，提取過程中采用超臨界流體萃取法，所得γ -癸內(nèi)酯濃度不低于84.3%,產(chǎn)量不低于14.38g/L0
[0020]本發(fā)明提供的上述生產(chǎn)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0021 ] 1.本發(fā)明為微生物發(fā)酵法制備γ -癸內(nèi)酯，γ -癸內(nèi)酯被呈有濃郁桃香和椰子香，存在于多種水果和乳制品中，是國際公認(rèn)安全的食品添加劑和藥品添加劑，對它的研究開發(fā)具有很好的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用潛力。
[0022]2.本發(fā)明對高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了發(fā)酵的工藝參數(shù)，提高了 γ-癸內(nèi)酯的產(chǎn)量，γ-癸內(nèi)酯濃度不低于84.3%，產(chǎn)量不低于14.38g/L以上，轉(zhuǎn)化率不低于48.4g/L，處于國內(nèi)領(lǐng)先水平。
[0023]3.本發(fā)明采取超臨界CO2萃取法，因此本方法可作為一種綠色、環(huán)保、無污染、安全且高效的提取方法有效提高了 γ-癸內(nèi)酯的得率，γ-癸內(nèi)酯萃率不低于67.8%。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明中利用解脂亞羅酵母生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0026]本發(fā)明提供一種解脂亞羅酵母Yarrowia Lipolytica C85#，所述解脂亞羅酵母Yarrowia Lipolytica C85#被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC N0.11736，保藏時間為:2015年11月25日。
[0027]如圖1所示，本發(fā)明還提供一種所述的解脂亞羅酵母生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的方法，將所述的解脂亞羅酵母發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生γ -癸內(nèi)酯。
[0028]在上述方法中，作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25°C_27°C，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為 280-288h。
[0029]在上述方法中，作為優(yōu)選，在發(fā)酵培養(yǎng)中，于培養(yǎng)開始后的64h、76h、92h和102h分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中按照質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)補(bǔ)加3%_4%的葡萄糖和2%-7%的蓖麻甲醇酸甲酯。
[0030]在上述方法中，作為優(yōu)選，在所述發(fā)酵培養(yǎng)中，初始攪拌速度為45-50rpm，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧低于30 %后，首先按照0.2vvm、0.3vvm和0.4vvm的順序每隔一定時間調(diào)整空氣流量，然后按照0.03MPa、0.04MPa和0.05MPa的順序每隔一定時間調(diào)整壓力，最后按照50rpm、60rpm和7Orpm的順序每隔一定時間調(diào)整攪拌速度。
[0031 ]在上述方案中，作為優(yōu)選，所述一定時間為5?lOmin。
[0032]在本發(fā)明的其中一個實(shí)施例中，作為優(yōu)選，培養(yǎng)過程中，在產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯之后還包括采用超臨界CO2方法萃取γ -癸內(nèi)酯。
[0033]在上述方案中，作為優(yōu)選，所述超臨界CO2方法中采取的溫度為30_40°C，壓力為10-15MPa，時間為 I.5-3.0h。
[0034]在上述方案中，作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含:葡萄糖30_40g/L，玉米漿50_60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐溫-80 8-10g/L，硫酸銨10_12g/L，硫酸鎂2.4-3.2g/L，磷酸鈉1.2-2.8g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.8g/L，VB2 5_10mg/kg和硫酸鐵20_30mg/L。
[0035]實(shí)施例1
[0036]本發(fā)明的方法，包括下列步驟:
[0037]1.發(fā)酵菌株:采用亞硝基胍(NTG)誘變篩選的解脂亞羅酵母(YarrowiaLipolytica)C85#。
[0038]亞硝基胍