一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的lamp檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔黃龍病也稱柑桔青果病，主要分布于亞洲、非洲、美洲的40多個(gè)國家和地區(qū)， 在我國部分地區(qū)發(fā)生普遍;是世界柑桔生產(chǎn)上的一種毀滅性病害;柑桔黃龍病病原屬原核 生物界、薄壁菌門、韌皮部桿菌屬(Liberobacter)，目前，全球共發(fā)現(xiàn)亞洲韌皮部桿菌(L. 881&1：；[0118)、非洲韌皮部桿菌(]^.3；^；[0311118)和美洲韌皮部桿菌(]^.311161'；[0311118)3個(gè)不同 種，目前在中國分布的柑桔黃龍病菌為亞洲種，亞洲柑桔黃龍病的為害癥狀不僅表現(xiàn)為使 葉片轉(zhuǎn)黃，還能使柑桔產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降；病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)使根系腐爛，甚至?xí)斐烧?桔園被毀，且至目前為止，柑桔黃龍病僅可防不可治，主要采取砍除病樹、防治媒介昆蟲等 措施進(jìn)行防控，因此對(duì)柑桔黃龍病菌的早期檢測(cè)鑒定尤其重要；目前柑桔黃龍病的檢測(cè)鑒 定技術(shù)主要有六種，包括田間診斷法、指示植物法、電鏡檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法、淀粉顯色 法、核酸分子檢測(cè)法;其中田間診斷簡便，但易與其他病害混淆，且與診斷者的學(xué)識(shí)經(jīng)驗(yàn)有 很大關(guān)系；指示植物法耗時(shí)長;電鏡檢測(cè)疫學(xué)檢測(cè)均易漏檢，淀粉顯色雖然快速、經(jīng)濟(jì)，但也 需與田間診斷結(jié)合憑經(jīng)驗(yàn)判斷；分子核酸分子檢測(cè)方法是目前檢測(cè)準(zhǔn)確率最高的一種方 法，其中包括常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)定量PCR方法、LAMP檢測(cè)法等，其中前兩種分子檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè) 環(huán)境、設(shè)施設(shè)備均有較高要求，不適合大規(guī)?？焖贆z測(cè)應(yīng)用;LAMP檢測(cè)方法由于具有操作簡 便、對(duì)環(huán)境要求低、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，目前在亞洲柑 桔黃龍病的檢測(cè)已有部分研究，但采用靶基因不同，其特異性引物、檢測(cè)準(zhǔn)確性等均不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為了能更好的防控柑桔黃龍病的發(fā)生，對(duì)感病的柑桔植株進(jìn)行早期診斷以 防止其進(jìn)一步大面積擴(kuò)散，經(jīng)過長期的試驗(yàn)研究與對(duì)比，提出一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍 病菌的LAMP檢測(cè)方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1)引物設(shè)計(jì)： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多重比對(duì)，分析序列的 保守區(qū)，利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V 4.0,設(shè)計(jì)LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內(nèi)引物FIP/BIP，針對(duì)6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，引物序列如下：

2) 核酸提?。?2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA冷凍保存?zhèn)溆茫?3) LAMP特異性檢測(cè)： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20補(bǔ)足至25yL; 3.2) 將反應(yīng)?0?管置于恒溫孵育器，651反應(yīng)8〇1^11，之后80°0下滅活51^11結(jié)束反應(yīng)。
[0005]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:步驟2中提取的DNA于-20°c保存?zhèn)溆谩?br>[0006]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的亞洲柑桔黃龍病LAMP快速 檢測(cè)技術(shù)操作簡便、對(duì)環(huán)境設(shè)施設(shè)備要求不高、成本低，且快速準(zhǔn)確，特別適合對(duì)于亞洲柑 桔黃龍病的大規(guī)模初篩，為柑桔黃龍病的檢測(cè)與防控提供了一種新的手段;本發(fā)明的檢測(cè) 方法靈敏度比普通PCR高10000倍。
【附圖說明】
[0007]圖1為柑桔四種病原菌DNA樣品的LAMP反應(yīng)曲線圖。
[0008]圖2為不同稀釋度DNA樣品的LAMP反應(yīng)曲線圖。
[0009] 圖3為不同稀釋度DNA樣品的普通PCR凝膠電泳圖。
[0010] 其中，1-柑桔潰瘍病菌;2-亞洲柑桔黃龍病菌A;3-亞洲柑桔黃龍病菌B;4-柑果莖 點(diǎn)霉菌;5-柑桔炭疽病菌;6-亞洲柑桔黃龍病菌C; 7-柑桔健康葉片;8-雙蒸水；11: HLB-IO*3 稀釋度DNA; 22: HLB-10-1 稀釋度DNA; 33: HLB-10-2稀釋度DNA; 44: HLB-10-3稀釋度DNA; 55 : HLB-10-4 稀釋度 DNA; 66: HLB-10-5 稀釋度 DNA; 77: HLB-10-6 稀釋度 DNA; 88: HLB-10-7 稀釋度 DNA〇
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0012]請(qǐng)參閱圖1-3,一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1) 引物設(shè)計(jì)： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多重比對(duì)，分析序列的 保守區(qū)，利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V 4.0,設(shè)計(jì)LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內(nèi)引物FIP/BIP，針對(duì)6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，引物序列如下：
2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA于-20°C保存?zhèn)溆茫?3)LAMP特異性檢測(cè)： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20補(bǔ)足至25yL; 3.2) 將反應(yīng)?0?管置于恒溫孵育器，651反應(yīng)8〇1^11，之后80°0下滅活51^11結(jié)束反應(yīng)。 [00 13] 實(shí)施例1 將本發(fā)明檢測(cè)方法應(yīng)用新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增設(shè)備一一用GENIE Π 便攜式基因熒光擴(kuò) 增儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，檢測(cè)所建立檢測(cè)方法的特異性與靈敏度，并將其結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè) 方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明的方法靈敏度高，特異性好;具體情況如下： (1) 特異性試驗(yàn)： 采用本發(fā)明的檢測(cè)方法，以柑桔黃龍病(3個(gè)樣）、潰瘍?。?個(gè)樣）、黑星病、炭疽病及健 康樣品DNA為模板，對(duì)雙蒸水作空白對(duì)照進(jìn)行LAMP反應(yīng)，檢測(cè)該方法的特異性，只有柑桔黃 龍病的3個(gè)樣品有擴(kuò)增，結(jié)果表明該方法的特異性好，如附圖1所示； (2) 靈敏度試驗(yàn)： 將DNA樣品依次稀釋為級(jí)，應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果 表明，應(yīng)用本檢測(cè)方法，l〇Q-l〇-6級(jí)出峰時(shí)間從9minl9sec至9min49sec不等，10- 7稀釋度沒有 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明DNA樣品的LAMP能檢測(cè)到10-6稀釋度，應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)方法對(duì)于相同稀 釋度的DNA樣品進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果顯示，普通PCR能檢測(cè)到10- 2稀釋度。表明本檢測(cè)方法 靈敏度比普通PCR高10000倍;如附圖2-3所示。
[0014]上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方 式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下 做出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 引物設(shè)計(jì)； 2) 核酸提??； 3. LAMP特異性檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 引物設(shè)計(jì)： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多重比對(duì)，分析序列的 保守區(qū)，利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V 4.0,設(shè)計(jì)LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內(nèi)引物FIP/BIP，針對(duì)6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，引物序列如下：2) 核酸提?。? 2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA冷凍保存?zhèn)溆茫? 3. LAMP特異性檢測(cè)： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各IyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶IyL，模板2yL，加 CldH2O補(bǔ)足至25yL; 3.2) 將反應(yīng)PCR管置于恒溫孵育器，65°C反應(yīng)80 min，之后80°C下滅活5 min結(jié)束反應(yīng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，步 驟2中提取的DNA于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)引物設(shè)計(jì)：采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物；2)核酸提?。喊凑誄TAB法提取柑桔葉片總DNA；3)LAMP特異性檢測(cè)：取5×Reaction？Buffer、F3和B3引物、FIP和BIP引物、Mg2+、dNTPs、Bst？DNA聚合酶、模板、加ddH2O定容至25μL；將反應(yīng)PCR管置于恒溫孵育器反應(yīng)，之后滅活結(jié)束反應(yīng)；本發(fā)明操作簡便、對(duì)環(huán)境設(shè)施設(shè)備要求不高、成本低，快速準(zhǔn)確，特別適合對(duì)于亞洲柑桔黃龍病的大規(guī)模初篩，為柑桔黃龍病的檢測(cè)與防控提供了一種新的手段。
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105524986
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511003710
【發(fā)明人】黃麗莉, 李茵, 祝建新, 羅濤朋, 劉 英
【申請(qǐng)人】江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日