防治核桃炭疽病的生防菌株及其篩選方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于防治核桃炭疽病的生防菌株技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防治核桃炭疽病 的真菌生防菌株及其篩選方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近些年隨著云南省政府大力發(fā)展核桃種植，各地依托當(dāng)?shù)貎?yōu)勢資源積極發(fā)展核桃 產(chǎn)業(yè)。該省的核桃生產(chǎn)在全國核桃生產(chǎn)中占有非常重要的地位，其核桃的栽培面積和產(chǎn)量 約占全國的1/3,作為云南省重要的木本油料植物，核桃在改善當(dāng)?shù)厝藗兩钏?，提高?會效益方面發(fā)揮著重要作用。大理州漾濞彝族自治縣作為云南省五個(gè)"全國經(jīng)濟(jì)林核桃之 鄉(xiāng)"之一，其種植核桃具有較為悠久的歷史，核桃產(chǎn)量、品質(zhì)均居云南省首位。然而，核桃炭 疽病作為近幾年來核桃上的重要真菌病害，嚴(yán)重危害著當(dāng)?shù)睾颂耶a(chǎn)業(yè)的健康、有序、快速發(fā) 展。據(jù)近些年對漾濞核桃產(chǎn)區(qū)核桃炭疽病的病害調(diào)查結(jié)果，嚴(yán)重年份該病發(fā)生率高達(dá)90% 以上，對當(dāng)?shù)睾颂业纳a(chǎn)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 限于生產(chǎn)上對于該病害的防治措施主要依賴于化學(xué)藥劑，而病原菌抗藥性逐年顯 現(xiàn)，急需開發(fā)適合生產(chǎn)的優(yōu)良藥劑。目前，學(xué)術(shù)界對于化學(xué)藥劑的替代品生防菌的研究逐年 增加，對生防菌的篩選工作多集中于對農(nóng)作物、蔬菜等方面的報(bào)道上。就核桃炭疽病的生防 菌篩選而言，王清海，牛贍光，劉幸紅，等.核桃炭疽病高效生防菌株鑒定及抑菌活性[J].山 東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，（3) :335-337報(bào)道了研究發(fā)現(xiàn)短芽孢桿菌PF-2對該菌 的抑菌率最高，為88.47%，還有三株均屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌也對核桃炭疽病菌具有83% 以上的抑菌率，盡管如此，對于可作為核桃炭疽病的生防真菌的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有核桃炭疽病防治主要依賴化學(xué)藥劑的問題，本發(fā)明提出一種防治核桃 炭疽病的生防菌株，該生防菌株為真菌，其對核桃炭疽病菌均有80 %以上的抑菌活性，并且 穩(wěn)定性好。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種防治核桃炭疽病的生防菌株，為鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)YB-4_15， 保藏單位：中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱:CGMCC，保藏日期:2015-12-07,保藏號：CGMCC No. 11809。
[0007] 進(jìn)一步，所述生防菌株菌絲對光照條件不敏感，孢子產(chǎn)生需要光照條件。
[0008] 進(jìn)一步，所述生防菌株菌絲生長的適宜溫度為12-28°c，適宜pH值為4-8。
[0009] 進(jìn)一步，所述生防菌株生長的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種防治核桃炭疽病的生防菌株的篩選方法，包括以 下步驟：
[0011] 1) 土壤微生物分離及指示菌株
[0012] 選擇大理州漾擤縣光明村發(fā)病不同的核桃植株根際土壤，|產(chǎn)去表土層，取l〇-15cm 處土樣，采用土壤稀釋平板法進(jìn)行分離，28°C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d(天)后，純化長出的菌 株，再將純化菌株放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?；指示菌株為膠孢炭疽菌（Col letotrichum gloeosporioides)；
[0013] 2)生防菌株篩選
[0014] 初篩:將步驟1)的土壤純化菌株以及指示菌株接種于PDA平板進(jìn)行活化，采用平板 對峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選，即將一塊直徑為6mm的指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距 離的圓周上等距離接4塊直徑為6mm 土壤純化菌株，記錄指示菌株直徑，篩選出效果較好的 菌株得到初篩菌株；
[0015] 復(fù)篩：一塊指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接2塊 初篩菌株，篩選出對指示菌株抑制作用效果明顯、穩(wěn)定的生防菌株。
[0016] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種防治核桃炭疽病的生防菌株在制備防治核桃炭 疽病菌劑方面的應(yīng)用，將生防菌株接種于含牛肉浸膏的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵，將發(fā)酵液進(jìn)行離心，上清液用細(xì)菌過濾器過濾，即得無菌濾液菌劑。
[0017] 進(jìn)一步，所述牛肉浸膏的含量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5%。
[0018] 進(jìn)一步，所述發(fā)酵溫度為28°c，所述液體培養(yǎng)基的pH值為7。
[0019] 進(jìn)一步，所述無菌濾液菌劑抑菌處理溫度為12_45°C。
[0020] 進(jìn)一步，所述無菌濾液菌劑抑菌處理溫度為28-30 °C。
[0021]本發(fā)明的有益效果：
[0022]本發(fā)明通過對核桃植株根際土壤進(jìn)行微生物分離和病原菌對峙培養(yǎng)，分離純化得 到能夠防止核桃炭疽病的生防菌株，該菌株能夠?qū)颂姨烤也【?0%以上的抑菌活 性，同時(shí)促進(jìn)核桃植株的生長。
[0023] 本發(fā)明的生防菌劑屬生物制劑，不會對環(huán)境和生態(tài)造成污染，其有利于核桃的無 公害生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0025] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中生防菌株初篩與復(fù)篩結(jié)果示意圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3生防菌株的菌落形態(tài)圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3生防菌株的孢子圖；
[0028] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3生防菌株的產(chǎn)孢瓶體圖；
[0029] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4生防菌株分子鑒定結(jié)果圖；
[0030] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例5不同光照條件對生防菌株的菌絲生長影響的結(jié)果圖；
[0031 ]圖7為本發(fā)明實(shí)施例5不同溫度條件對生防菌株的菌絲生長影響的結(jié)果圖；
[0032] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例5生防菌株在不同培養(yǎng)基的生長情況的結(jié)果圖；
[0033] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例5不同pH值對生防菌株的菌絲生長影響的結(jié)果圖；
[0034] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例7不同濃度的無菌濾液菌劑抑菌效果圖；
[0035] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例8不同溫度不同時(shí)間處理無菌濾液菌劑的抑菌效果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 土壤微生物分離及指示菌株
[0038]選擇大理州漾擤縣光明村發(fā)病不同的核桃植株根際土壤，|產(chǎn)去表土層，取10-15cm 處土樣，采用土壤稀釋平板法進(jìn)行分離，平板為PDA平板，28 °C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d后，每 處理重復(fù)4次，編號，純化生長的菌株，再將純化菌株放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0039] 指示菌株為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides)，本實(shí)施例中選用西 南林業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-Ι，該菌株已經(jīng)在《經(jīng)濟(jì)林研究》 2015年9月第33卷第3期的文獻(xiàn)中報(bào)道過，作者為韓長志與霍超，題目名稱為"核桃炭疽病生 防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析"。該實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)承諾自該專利申請日起20年內(nèi) 向公眾發(fā)放該生物材料。
[0040] 該P(yáng)DA培養(yǎng)基的制作參見中國農(nóng)業(yè)出版社1998年出版的方中達(dá)著作的植病研究方 法。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042]初篩:將實(shí)施例1獲得的土壤純化菌株以及指示菌株接種于PDA平板進(jìn)行活化，采 用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選，每處理重復(fù)3次，均置于28°C恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待對照菌 的菌絲長滿培養(yǎng)皿時(shí)，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，觀察并記錄結(jié)果；
[0043]即將一塊指示菌株置于roA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接4塊土 壤純化菌株，記錄指示菌株大小，篩選出抑制效果較好的菌株得到初篩菌株;初篩結(jié)果顯 示，共有35個(gè)菌株的抑菌率在70%以上。
[0044]復(fù)篩:一塊指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接2塊 初篩菌株，篩選出對病原菌作用效果明顯、穩(wěn)定的生防菌株。經(jīng)過復(fù)篩發(fā)現(xiàn)其中的24個(gè)菌株 抑菌率為80%以上。
[0045]兩次篩選共獲得3株抑菌效果均在80%以上的菌株，其編號分別為YB-4-15、YB-8-11-1和YB-7-9-1，上述菌株中，尤以YB-4-15抑菌作用穩(wěn)定、效果明顯參見圖1與表1。圖1中A 表示初篩結(jié)果，圖1中B表示復(fù)篩結(jié)果。
[0046] 表1經(jīng)初篩與復(fù)篩獲得的土壤拮抗菌株
[0047]
[0048] 實(shí)施例3
[0049]將生防菌株YB-4-15進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定
[0050]將生防菌株YB-4-15接種在PDA平板上培養(yǎng)，觀察并記載菌落特征，培養(yǎng)7d后，挑取 菌絲菌落制備玻片，顯微鏡下觀察菌株的微觀形態(tài)，并測定其孢子大小，并根據(jù)魏景超編 著、中國農(nóng)業(yè)出版社1979出版的真菌鑒定手冊進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果如下：
[0051 ] PDA培養(yǎng)基上，YB-4-15形成白色菌落，其背面也為白色，無色素，老化后培養(yǎng)基平 板顏色變?yōu)榈S色，有香氣(見圖2);顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其具有生長稠密的分生孢子堆，可形成 白色皰突，后期分生孢子堆變?yōu)榈G色，后綠色加深，分生孢子梗2.0-3.5μπι，產(chǎn)孢瓶體對 生、輪生或稀疏、不規(guī)則著生與孢子梗上，常2-4輪生，少數(shù)單生。瓶體一般為燒瓶形，頂端細(xì) 長，基部收縮，瓶體直，長(5.0-)6.5-10.0(-12.0)μπι，瓶體中間膨大處2.5-3.5μπι，長寬比為 2.0-4.0(-5.5)，基部寬為1.5-2.5μπι ;分生孢子綠色，細(xì)橢球形，大小為3.0-5.5 X 2.5-3.5μ m，長寬比為1.1-1.8,壁光滑(見圖3與圖4)。通過上述形態(tài)學(xué)觀察，根據(jù)真菌鑒定手冊，初步 將該菌鑒定為康氏木霉(Trichoderma koningii 0ud)〇
[0052] 實(shí)施例4
[0053] 生防菌株YB-4-15ITS序列測定
[0054] 1)ΥΒ-4-15 基因組 DNA 制備
[0055] 將純化的菌絲塊（1 cm X 1 cm)于新鮮的PDA液體培養(yǎng)基中黑暗、28 °C恒溫培養(yǎng)箱培 養(yǎng)3d，采用CTAB法提取該菌株的基因組DNA。
[0056] 2)rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與序列測定
[0057] 采用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物擴(kuò)增ITS1-5.8S rDNA-ITS2片斷PCR，測序獲得了 生防菌株YB-4-15的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列，見序列表SEQ ID N0:3。擴(kuò)增引物序列為：
[0058] ITS1:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，見SEQ ID NO: 1 所示；
[0059] itsls'-tcctccgcttattga