含抗稻瘟病基因重組dna片段植株的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳學(xué)、基因組學(xué)和分子育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及全基因組選擇育種 技術(shù)以及利用該技術(shù)快速精確選育含抗稻瘟病基因重組DNA片段植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占 11 %~30 %，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對(duì)稻瘟病研究的逐步深入，許 多水稻抗稻瘟病基因 DNA片段相繼被定位和克隆。其中，水稻第6染色體的Pi2區(qū)間被定 位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50,該區(qū)間包含一個(gè)稻瘟病 抗性基因的基因簇（Dai 等，2010 ;Qu 等，2006 ;Wang 等，2012 ;Zhou 等，2006 ;Xiao 等，2012 ; Liu 等，2002 ;Liu 等，2011 Jiang 等，2012 ;Zhu 等，2012 ;Deng 等，2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株的選育方法，包括 以下步驟：
[0004] (1)以水稻'空育13Γ為輪回親本，含抗稻瘟病基因 DNA片段的'K22'為供體 親本進(jìn)行雜交和回交，獲得BC^代；利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4和負(fù)向選擇標(biāo)記RM19814、 RM19835對(duì)BC^代進(jìn)行抗稻瘟病基因 DNA片段單側(cè)同源重組片段篩選，并用水稻全基因組 育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇；
[0005] (2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株與受體親本'空育13Γ進(jìn)行回交，獲得BC2Fi代， 利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有抗稻瘟病基因 DNA片段的重組單株，然后 用水稻全基因組育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇；
[0006] (3)選擇背景回復(fù)好的重組單株再次與受體親本'空育13Γ進(jìn)行回交，獲得BC3Fi 代，利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4和負(fù)向標(biāo)記RM19814、RM19835對(duì)BCR代進(jìn)行抗稻瘟病基因 DNA片段另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景 選擇，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段小，且背景回復(fù)好的重組單株；
[0007] (4)選中的重組單株自交一次，獲得BC3F2代；利用正向選擇標(biāo)記Pi2_4對(duì)BC 3F2代 進(jìn)行檢測(cè)，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景選擇，最終獲得目標(biāo)基因 組DNA片段純合，且背景完全回復(fù)的含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株；
[0008] 其中，所述抗稻瘟病基因重組DNA片段兩側(cè)的同源重組片段的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
[0009] 本發(fā)明還提供利用上述方法獲得的一個(gè)抗稻瘟病基因重組DNA片段，該片段兩側(cè) 的同源重組片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述抗稻瘟病基因重組DNA片段的方法。根據(jù)該片段兩側(cè) 的同源重組片段的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，以待測(cè)水稻基因組為模板， 進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0011] 優(yōu)選地，采用Sanger測(cè)序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0012] 用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID No. 1所示同源重組片段的引物組合為：
[0013] 組合 I
[0014] 擴(kuò)增引物：A08X27F: 5 ' -GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3 '
[0015] A08X27R: 5 ' -CTCACAATACCTTACCCACC-3 '
[0016] 測(cè)序引物：A08X27F: 5 ' -GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3 '
[0017]組合 II
[0018] 擴(kuò)增引物：A08)(15F:5' -TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3'
[0019] A08X15R:5' -TTAGCTTACCTCAAATTACCG-3'
[0020] 測(cè)序引物：A08)(15F:5, -TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3，
[0021] 組合 III
[0022] 擴(kuò)增引物：A08)(16F:5' -CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3'
[0023] A08X16R: 5 ' -CACGCCCTAATACTACTACCTCC-3 '
[0024] 測(cè)序引物：A08X16F: 5，-CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3，。
[0025] 以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè) 序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID No. 1序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣 品中含有SEQ ID No. 1所示同源重組片段。
[0026] 用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID No. 2所示同源重組片段的引物組合為：
[0027] 組合 IV
[0028] 擴(kuò)增引物：A〇8X23F:5，-TCGAATTTACTACCCGTGAGC- 3，
[0029] A08X23R: 5，-TTTGGCTCTGACCCGCTTG-3 '
[0030] 測(cè)序引物：A08X23F: 5 ' -TCGAATTTACTACCCGTGAGC-3 '
[0031] 組合 V
[0032] 擴(kuò)增引物：A08X42F: 5，-CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3 '
[0033] A08X42R: 5 ' -GATACATACCCGCACATTCG-3 '
[0034] 測(cè)序引物：A08X42F: 5 ' -CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3 '
[0035] A08X42R: 5 ' -GATACATACCCGCACATTCG-3 '
[0036] 組合 VI
[0037] 擴(kuò)增引物：A08X40F: 5 ' -TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3 '
[0038] A08X40R: 5 ' -AAAGTTGAGGGCGATTGTG-3 '
[0039] 測(cè)序引物：A08X40F: 5 ' -TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3 '
[0040] 組合 VII
[0041] 擴(kuò)增引物：A08X36F: 5 ' -TGGACTACATTAGACGCATTG-3 '
[0042] A08X36R: 5 ' -AAAGTACATCGAGTCCTTGAG-3 '
[0043] 測(cè)序引物：A08X36F: 5 ' -TGGACTACATTAGACGCATTG-3 '。
[0044] 以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè) 序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID No. 2序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣 品中含有SEQ ID No. 2所示同源重組片段。
【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中A08-19水稻Rice60K全基因組育種芯片檢測(cè)結(jié)果；其 中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理 位置[以兆堿基（Mb)為單位]，圖中第6號(hào)染色體上黑色線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入一個(gè)抗稻 瘟病基因重組DNA片段的RecA08-19。
[0046] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中RecA08_19抗稻瘟病基因重組DNA片段上游同源重組片 段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，圖中A08-19為獲得的新品系， KY131為受體親本'空育13Γ，'K22'為供體親本。
[0047] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中RecA08_19抗稻瘟病基因重組DNA片段下游同源重組片 段測(cè)序比對(duì)結(jié)果。
[0048] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中RecA08_19抗稻瘟病基因重組DNA片段兩側(cè)同源重組片 段的結(jié)構(gòu)圖；其中，（A)為基因上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為基因下游同源重組片段結(jié) 構(gòu)圖，上方堿基為供體'K22'的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體'空育13Γ的SNP或 InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來(lái)源于'空育13?；蚪M區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于'K22'基因組 區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目（bp)為單位。
[0049] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中A08-19稻瘟病抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果；圖中所示葉片依次 為：(A)稻癌病感病品種而江新團(tuán)黑谷；(B)原品種'3?育131 ' ；（C)改良新品系A(chǔ)08-19 ; (D) 稻瘟病抗病品種谷梅4號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0051] 本發(fā)明中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋 第 6. 1版（http://rice. plantbiology. msu. edu/)〇
[0052] 實(shí)施例1水稻'空育13Γ