一種福壽螺抗逆相關(guān)基因海藻糖合成酶基因、其編碼的蛋白質(zhì)及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及屬于淡水軟體動物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種福壽螺抗逆相關(guān)基因 海藻糖合成酶基因、其編碼的蛋白質(zhì)及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 福壽螺(Pomacea)又名大瓶螺、蘋果螺，是國際性的惡性有害生物。該螺原產(chǎn)于南 美洲亞馬遜河流域，上世紀80年代初期引入亞洲，因管理不善和口味不佳被棄養(yǎng);福壽螺迅 速擴散到田間，部分地區(qū)泛濫成災(zāi)，對水稻、巧白等水生作物造成嚴重的危害。福壽螺具有 極強的繁殖力，擴散和蔓延速度快，目前已成為長江W南大部分省區(qū)的嚴重農(nóng)業(yè)有害生物。 現(xiàn)今福壽螺已廣泛分布在我國北締30° W南的大部分省區(qū)，包括浙江、福建、廣東、海南、廣 西、云南、貴州、湖南、江西、重慶、四川、安徽省等，種群密度十分巨大，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重 影響。
[0003] 在入侵過程中，由于入侵地周圍環(huán)境條件的變化，福壽螺會遭受不同的逆境脅迫 (如高溫、冷凍、干燥、高滲透壓及氧化作用等）。為了對抗運些逆境脅迫，生物在進化過程中 逐步形成了一些巧妙的保護機制，W維持它們的生態(tài)適應(yīng)性或者保證它們能夠在不利條件 下生存下來。福壽螺為了適應(yīng)環(huán)境變化而面對逆境會發(fā)生不同的反應(yīng)，通常是通過基因表 達的重建而改變其生理狀態(tài)，包括分子伴侶(mole州lar chaperones)的合成和應(yīng)激蛋白的 合成，如熱激蛋白化 eat shock protein,Hsp),冷休克蛋白（Cold shock protein,Csp)和 抗凍蛋白（Anti打eeze protein,AFP)等，或者是改變酶活性、蛋白質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)。在極端 環(huán)境條件下生物除了合成新的蛋白質(zhì)外，大多數(shù)生物還能通過體內(nèi)調(diào)節(jié)合成一些低分子量 共存的溶解物(如海藻糖和甘露醇等）W抵御外界環(huán)境對自身的傷害，運些小分子量物質(zhì)能 維持生物膜的完整性、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性，起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。海藻糖是運類 低分子量共存的溶解物的典型代表，細胞內(nèi)的海藻糖具有在脅迫環(huán)境(如高溫、冷凍、干燥 脫水或高滲透壓等）中防止蛋白質(zhì)聚集和幫助蛋白質(zhì)正確折疊的功能，從而穩(wěn)定細胞膜和 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)使細胞保持活力。海藻糖作為生物對抗環(huán)境脅迫的重要應(yīng)激保護物質(zhì)，在不 同的生物體中存在多種不同的合成和分解代謝途徑，其相關(guān)基因被相繼克隆和分析。海藻 糖的合成、分解及其調(diào)控是生物抗逆的重要機制，其相關(guān)基因的研究也是海藻糖生物工程 的重要基礎(chǔ)。
[0004] 海藻糖既是一種膽藏性糖類，又是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物，廣泛存在于細菌、酵母、 絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內(nèi)。海藻糖對生物體具有非常重要的生物學 意義，它是能源和碳源的儲備物，是蛋白質(zhì)和生物膜分子在脫水、高溫、氧自由基、低溫等惡 劣環(huán)境中的穩(wěn)定劑和保護劑，是信號傳感復(fù)合物和生長調(diào)控因子，還是某些細菌細胞壁的 組分之一。迄今已發(fā)現(xiàn)至少5種不同的海藻糖合成途徑，分別為TPS/TPP途徑、TreS途徑、 TreY/化eZ途徑、TreP途徑和TreT途徑。5種合成途徑中，TPS/TPP途徑在自然界中分布最為 廣泛，在真核生物、真細菌和古生菌中都有發(fā)現(xiàn)途徑應(yīng)用最為廣泛。海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)是海藻糖合成的限速酶。目前，已有多種昆蟲的 海藻糖合成酶基因（TPS)被克隆，如埃及斑蚊
[0005] Aedes aegypti(XM_001657763)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(EF051258)、果蛹 Drosophila melanogaste;r(NM_134983)、棉鈴蟲
[0006] Helicove;rpa a;rmigera(DQ086235)、虐蚊Anopheles gambiae(EAA12459)等，但是 對其功能的研究還相對較少。最近，很多生物學家致力于開發(fā)海藻糖合成酶及海藻糖酶抑 制劑的新型農(nóng)藥，試圖通過阻斷生物體內(nèi)海藻糖的分解和合成來達到控制害蟲和殺菌的目 的。
[0007] 福壽螺在全國各中、低締度均有廣闊分布的重要原因是與其對溫度的耐受能力分 不開的，運也是福壽螺在新生境能夠成功定殖的重要原因。Wada(2011)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)冷馴化的 福壽螺在0°C下存活2d的概率不到50%，0°C下處理5d螺全部死亡；而經(jīng)過冷馴化后，超過 65%的福壽螺在0°C下能存活5dW上。福壽螺的耐寒性具有季節(jié)性規(guī)律，夏季的福壽螺無法 在〇°C下存活5d，但冬季的螺在同樣處理下存活率將近100%，說明福壽螺具有低溫適應(yīng)機 制(Wada，2007)。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，在6~15°C范圍內(nèi)，15 °C時福壽螺幼螺存活率最 高，達100% ;12°C時存活率下降至63% ;9°C時絕大部分幼螺死亡，存活率僅為7% ;6°C時無 一存活，生存時間最短為2天，最長也僅7天，平均生存時間為4.10±0.24天。此外，6°C、9°C 時的LT50分別為4天和24天。結(jié)果表明，不同低溫對幼螺生存時間的影響差異極顯著(x2 = 193.31，壯=3，P<0.001)，其壽命隨溫度的降低而變短。也有報道表明，福壽螺在0°C下能夠 存活15~20d，-3°C下能夠存活2d，-6°C條件下能存活化(Mochida，1991)，運可能與其地理 種群的分化有關(guān)(董勝張等，2010)。趙本良等(2012)首次證實了入侵我國華南地區(qū)的福壽 螺的過冷卻點存在，平均在-7°C左右。福壽螺的運種過冷卻防御機制有利于其適應(yīng)低溫環(huán) 境，存在著進一步向北擴散的生態(tài)風險(Matsukura et曰1.，2009)。
[0008] 雖然有關(guān)海藻糖合成酶基因的研究已經(jīng)比較多，大量編碼海藻糖合成酶酶的cDNA 序列也得到了克隆，但是福壽螺作為一種世界性的外來入侵生物，有關(guān)福壽螺中海藻糖的 功能和作用目前尚無相關(guān)研究報道。通過本發(fā)明獲得的福壽螺海藻糖合成酶基因，能為拓 展水生軟體動物生理相關(guān)基因和功能的研究奠定基礎(chǔ)，更為有效控制福壽螺擴散危害提供 理論依據(jù)和實踐參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，并提供一種福壽螺抗逆相關(guān)基因海藻 糖合成酶基因、其編碼的蛋白質(zhì)及其克隆方法。該基因名稱為化TPS。具體技術(shù)方案如下：
[0010] -種福壽螺抗逆相關(guān)基因海藻糖合成酶基因，該基因具有（i)或（ii)所述核巧酸 序列之一：
[0011] (i)序列表中的SEQ ID NO:2或者其N-端缺失3-150個核巧酸殘基且具有相同開放 閱讀框的DNA序列；
[0012] (ii)與（i)限定的dm序列具有90%-95%W上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA序列。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種福壽螺抗逆相關(guān)基因海藻糖合成酶基因編碼的 蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有(i)或（ii)所述氨基酸序列之一：
[0014] (i)具有序列表中SEQ ID N0:1或其N-端缺失1至50個氨基酸殘基的氨基酸序列；
[0015] (ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加1至23個氨基酸且具有調(diào)控 淡水軟體動物抗逆性功能的由（i)衍生的蛋白質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明的第Ξ個目的在于提供一種所述基因的克隆方法，包括如下步驟：
[0017] 1)取新鮮福壽螺肌肉組織50mg-100mg用DEPC水沖洗3-5次，迅速置于液氮中保存；
[0018] 2)福壽螺肌肉組織的總RNA提取:在液氮條件下將福壽螺肌肉組織研磨成細粉狀， 然后轉(zhuǎn)移到含有0.3-0.5mL細胞裂解液的離屯、管中；提取福壽螺肌肉組織的總RNA;
[0019] 3)反轉(zhuǎn)錄合成福壽螺肌肉組織的cDNA;
[0020] 4)利用CODE冊P程序設(shè)計兼并引物；
[0021] 5)利用步驟4)設(shè)計的兼并引物，PCR擴增海藻糖合成酶基因中間片段cDNA序列；
[0022] 6)克隆福壽螺TPS基因的3 '端和5 '端cDNA序列；
[0023] 7)將步驟5)和6)中獲得的Ξ個cDNA片段拼接獲得TPS基因的全長序列。將全長目 的片段與克隆載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色菌落進行PCR 鑒定，將陽性克隆進行測序；
[0024] 8)將目的基因通過表達載體導(dǎo)入原核表達系統(tǒng)，驗證菌落對低溫的耐受力，從而 驗證目的基因的功能；
[0025] 所述的細胞裂解液組成為： 異硫氯酸脈 24重量份， ,1十二繞基硫酸補 0.4重量份，
[0026] 尿素 0.4重量份， 氯化鋪 0.2重量份，
[0027] 加入25重量份DEPC水，定容至50體積。
[002引所述的兼并引物序列為：上游引物5 ' -TCCACga5^taycayy t-3 '，下游引物5'- 0：17660：40：466?。日估。沈扣-3'。？0?擴增條件為94°(：預(yù)變性3111111;然后941：303,551：303， 72°Clmin，30個循環(huán);72°C延伸10°C。；所述的大腸桿菌感受態(tài)為D冊a或者JM109。所述的原 核表達系統(tǒng)為大腸桿菌化21表達系統(tǒng)。所述的表達載體為pET-20b( + )。所述的克隆載體為 pMD18-T Vector。
[0029] 本發(fā)明的有益效果是：采用上述方案，克隆入侵生物福壽螺海藻糖合成酶基因 (TPS)，獲得了ITS的全長基因，測序后經(jīng)Blasts比對，發(fā)現(xiàn)此DNA產(chǎn)物與其他物種來源的TPS 基因具有相似性。本發(fā)明所用的CODE冊P程序，設(shè)計的兼并引物可信性強