一種利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶制備l-叔亮氨酸的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶制備L-叔亮氨酸的方法，屬 于酶工程和手性醫(yī)藥中間體制備技術領域。
【背景技術】
[0002] 光學純L-叔亮氨酸，所含的叔丁基團不僅具有空間位阻效應還具有較強的疏水 性，從而被廣泛用作不對稱催化合成的模板。同時其作為一種非自然界的氨基酸，也常常應 用于藥物活性肽當中。有研究報道了L-叔亮氨酸用于抗腫瘤藥物試劑，抗艾滋病蛋白酶抑 制劑等藥物。正是由于L-叔亮氨酸的廣泛應用，大量的合成方法被開發(fā)報道。其中主要包括 化學拆分法、化學不對稱合成法、酶拆分法，以及酶還原氨基化合成法(Bo_arius et al.， 1995)。由于近年人們環(huán)保意識的增強，具有反應條件苛刻，反應流程復雜，反應效率低的化 學合成方法逐漸被生物合成法代替。在酶拆分合成的方法中，主要用到的一些酶包括青霉 素?；?，脂肪酶，蛋白酶等（Abderhalden，F(xiàn)aust，&Haase，1934; Agosta et al ·，2006 ; Turner，Winterman，McCague，Parratt，&Taylor, 1995)。由于酶拆分方法存在著操作步驟繁 瑣以及理論產(chǎn)率只有50%的原因，一直沒有相關方法工業(yè)應用的報道。
[0003] 酶還原氨基合成方法，具有操作簡單以及理論產(chǎn)率100%的特點。目前主要用到的 酶包括兩種，分別是側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)移酶和亮氨酸脫氫酶。Hong等報道了利用側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)移酶 合成L-叔亮氨酸，轉(zhuǎn)化率大于90%，但是催化的底物濃度過低達不到工業(yè)要求(Hong，Cha， ￥皿，&燈111，2010)。另外一種利用亮氨酸脫氫酶合成1^-叔亮氨酸在90年代由0叫11^ &(德國） 公司開發(fā)，并應用于工業(yè)生產(chǎn)。該方法運用酶膜反應器，將亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶固定 在酶膜上，其中甲酸脫氫酶能夠催化NAD+生成NADH，實現(xiàn)輔酶的再生，減少輔酶的用量 (Liese，Seelbach，&Wandrey，2006)。亮氨酸脫氫酶催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸被認 為是最有工業(yè)前景的合成路徑。
[0004] 近些年來關于亮氨酸脫氫酶合成路徑的專利報道包括中國專利201110202325.4， 201210508084.0，201410695848.0，201310044292.4等。這些合成路徑都存在以下問題：1. 反應需要外加輔酶，而輔酶價格昂貴，經(jīng)濟性差，如果能夠在合成工程中不加入輔酶的話， 將會大幅度減少工業(yè)生產(chǎn)過程的成本;2.甲酸脫氫酶活性低，在不對稱轉(zhuǎn)化過程中需要添 加大量的甲酸脫氫酶，才能夠充分發(fā)揮亮氨酸脫氫酶催化合成效果，增加了酶投入的成本； 3.反應效率較低，正是由于反應過程中用到的活性較低的甲酸脫氫酶，影響輔酶轉(zhuǎn)化效率， 增加完全轉(zhuǎn)化底物所需要的反應時間，使得反應效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問題，本發(fā)明利用共表達亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶菌株的破碎 粗酶液作為催化劑，進行催化三甲基丙酮酸生產(chǎn)L-叔亮氨酸。本發(fā)明用到的葡萄糖脫氫酶 相對甲酸脫氫酶具有更高的酶活，從而提高輔酶利用效率。采用粗酶液的反應形式能夠忽 略底物對于菌體細胞的抑制，提高底物濃度。通過在菌體培養(yǎng)過程中外加煙酸，提高胞內(nèi)輔 酶濃度，而實現(xiàn)反應中零輔酶添加。最終，實現(xiàn)了利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶來高 效制備L-叔亮氨酸。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種制備L-叔亮氨酸的方法，是在含有葡萄糖、底物三甲基 丙酮酸反應體系中添加共表達亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的重組菌的細胞破碎粗酶液， 攪拌反應。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法中底物三甲基丙酮酸濃度0.5-1.2M，葡萄 糖濃度是底物濃度的1.0-1.3倍。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應體系的溫度控制在20-35°C，pH控制在7.5-9.0。優(yōu)選溫度為30 °C，pH為8.5。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pH是通過氨水進行控制。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應的時間為1-2.5小時。優(yōu)選反應時間為 1.5h〇
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應體系中每L含有20-60g(濕重）重組菌的細 胞破碎液，優(yōu)選30g/L。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為100_300r/min，優(yōu)選為200r/min。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物三甲基丙酮酸濃度1M，葡萄糖濃度是1.2M， 粗酶液是30g/L(濕重)細胞得到的，反應溫度是30 °C，pH是8.5，時間為1.5h。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶分別來源于 Bacillus cereus和Bacillus sp〇
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述粗酶液的制備：（1)構建共表達氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1的亮氨酸脫氫酶和氨基酸序列如SEQ ID N0.2的葡萄糖脫氫酶的重組菌；（2) 對重組菌進行培養(yǎng)，誘導菌株表達亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，得到發(fā)酵液；（3)將發(fā)酵 液離心取細胞、洗滌，然后超聲破碎，即得粗酶液。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟（1)具體是:在葡萄糖脫氫酶GDH和亮氨酸 脫氫酶LDH之間加入SD-AS序列得到基因⑶H-SD-AS-LDH，然后連接到pET28a質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21宿主中，得到重組菌。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述SD-AS序列為GGAGATATACC(SED ID從).3所示）。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)中重組菌進行培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基中 添加有輔酶合成路徑中的前體物質(zhì)以提高菌體內(nèi)的輔酶濃度。當添加有前體物質(zhì)時，用于 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-叔亮氨酸時，細胞添加量可以減少至20-30g/L(濕重）；不添加前體物質(zhì)時，細胞 添加量提高至40g/L以上，反應過程不需要添加輔酶、轉(zhuǎn)化率高。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述前體物質(zhì)是煙酸、煙酰胺、L-色氨酸或L-天冬氨 酸中的任意一種或者多種;優(yōu)選地，所述前體物質(zhì)是煙酸。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，其余為水，使用前加入硫酸卡那霉素50yg/mL);所述培 養(yǎng)是在37 °C、200r/min培養(yǎng)至菌體0D6QQ達到0.6-2.0，然后加入終濃度為0.1 mM的IPTG于在 18°C 培養(yǎng) 2-24h;
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的培養(yǎng)基為自誘導培養(yǎng)基(無水葡萄糖 0.5g/L，甘油5g/L，KH2P〇4 6.8g/L，MgS〇4 0.48g/L，Na2HP〇4 7.1g/L，Na2S〇4 0.71g/L，NH4Cl 2.67g/L，蛋白粉lOg/L，酵母粉5g/L;誘導物a-乳糖l〇g/L，pH 7.60，以去離子水配置，使用 前加入硫酸卡那霉素50yg/mL)，所述培養(yǎng)是在30-37°C、200r/min下培養(yǎng)時間為24-48h。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體是：（1)在葡萄糖脫氫酶GDH和亮氨酸 脫氫酶LDH之間加入序列如SEQ ID N0.3所示的SD-AS序列得到基因⑶H-SD-AS-LDH，然后連 接到pET28a質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主中，得到重組菌；（2)將重組菌在含有l(wèi)g/L 煙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并誘導菌株表達亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，培養(yǎng)后取菌體細胞、 洗滌；（3)在反應體系中，添加底物三甲基丙酮酸濃度1M，葡萄糖濃度是1.2M，30g/L細胞的 粗酶液，反應溫度是30°C，用氨水控制pH 8.5，反應1.5h。
[0023] 有益效果
[0024] 1、本發(fā)明利用的重組菌包含亮氨酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶和輔酶，在催化三甲基 丙酮酸合成L-叔亮氨酸的過程中，有效的利用菌體自身所含有的輔酶實現(xiàn)輔酶循環(huán)再生， 在催化反應的過程中不需要額外加入輔酶，實現(xiàn)了輔酶的零添加，節(jié)省輔酶的成本。
[0025] 2、本發(fā)明在單批次反應中，底物濃度達到130g/L進行催化反應(為報道的單批次 最高底物濃度），轉(zhuǎn)化率達到99%以上，反應時間縮短到1.5h以內(nèi)，時空產(chǎn)率達到2096gL一1d -1 〇
[0026] 3、本發(fā)明采用單一重組菌的粗酶液進行催化反應，具有催化劑制備過程簡單，催 化劑使用量少，催化效率高的特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明反應過程示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 底物的檢測條件為：SB-Aq Column(4.6*150mm，5um)，流速lml/min，紫外檢測器 210nm，流動相為20mM磷酸鉀/乙腈溶液(99.5:0.5v/v，pH2.0)，進樣量5ul。
[0029] 產(chǎn)物的檢測條件為:0180〇1111]111(4.6*25〇1]1111，511111)，利用0?4衍生化，流速11111/111；[11， 紫外檢測器338nm，流動相為50mM NaAc/乙腈溶液(80:20v/v，pH7.2)，進樣量10ul。
[0030] 實施例1:構建共表達亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌重組菌株
[0031] 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列設計引物，分別調(diào)取來源于Bacillus cereus和 Bacillus sp的亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶兩種酶基因，利用限制性內(nèi)切酶Xhol和Nhel 對目的基因與表達質(zhì)粒pET28a進行雙酶切，目的基因與載體連接之后獲得重組質(zhì)粒 pET28a-LDH和pET28a-GDH。再從兩種基因的表達質(zhì)粒出發(fā)，利用重疊延伸PCR技術在，兩個 基因之間加入SD-AS序列(GGAGATATACC)。設計包含SD-AS序列的引物，兩輪PCR之后獲得基 因⑶H-SD-AS-LDH，將該基因連接到表達載體pET28a上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主BL21中，獲得重 組菌E. co 1 i BL21 /pET28a-G-SD-AS-L，從而實現(xiàn)兩種酶在同一個質(zhì)粒上面串聯(lián)表達。
[0032] 實施例2: LB培養(yǎng)基誘導表達基因工程菌株
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