一株牛樟芝菌株及牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法
【專利摘要】一種牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，包括以下步驟：A、以牛樟芝菌株S-29為原料，先在麥芽汁斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)為樟芝斜面菌種；B、將樟芝斜面菌種接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)為液態(tài)種子；C、將液態(tài)種子接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中添加過氧化氫，利用過氧化氫氧化脅迫誘導(dǎo)菌絲體合成安卓奎諾爾類化合物。本發(fā)明方法簡單、高效，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值，由于添加過氧化氫誘導(dǎo)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生安卓奎諾爾及其衍生物，極大地縮減了牛樟芝液態(tài)菌絲體產(chǎn)品與其他形式培養(yǎng)物產(chǎn)品的功效差距。本發(fā)明方法生產(chǎn)的安卓奎諾爾及其衍生物可以應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域。CGMCC No.959020140909
【專利說明】
一株牛樟芝菌株及牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程，特別涉及一株牛樟芝菌株及牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法。 技術(shù)背景
[0002] 高等藥用真菌牛樟芝（Antrodia camphorata),又名牛樟燕，屬于擔(dān)子菌綱、多年 生擔(dān)子菌，只生長在臺灣地區(qū)的牛樟樹腐朽樹干的內(nèi)壁。在民間，牛樟芝長久以來被用作解 酒保肝的傳統(tǒng)藥方，用于治療肝臟疾病、食物和藥物所引起的中毒癥狀，以及腹瀉、腹痛、高 血壓、皮膚發(fā)癢和腫瘤疾病等，又被稱為靈芝之王、森林中的紅寶石。近年來，許多學(xué)者研究 顯示牛樟芝具有抗腫瘤、保肝、抗炎癥、抗氧化、抗疲勞等多種活性功能，尤其在抗腫瘤和緩 解酒精性肝損傷方面。由于牛樟芝的功效卓越，市場上對其子實(shí)體的需求也越來越高，然而 其野生子實(shí)體生長非常緩慢，并且唯一寄主牛樟樹十分稀缺，使得野生牛樟芝子實(shí)體價格 一路飆升，高達(dá)15000-20000美元/公斤，遠(yuǎn)高于靈芝、人參、冬蟲夏草等傳統(tǒng)藥材，極具開 發(fā)前景。
[0003] 牛樟芝菌絲體中藥理活性開發(fā)最深入的是安卓奎諾爾及其衍生物，屬于泛醌類化 合物，包括 Antroquinonol、Antroquinonol B 和 4-acetyl-Antroquinonol B 等，只在固態(tài) 發(fā)酵菌絲體中可以合成，而在液態(tài)發(fā)酵菌體中不能合成。牛樟芝安卓奎諾爾類化合物具有 良好的抗癌活性。Lee等人利用正己燒從牛樟芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中分離出Antroquinonol， 結(jié)果表明Antroquinonol對MCF-7和MDA-MB-231 (人乳腺癌細(xì)胞）、Ifep3B和IfepG2 (人 肝癌細(xì)胞）、DU-145和LNCaP(人前列腺癌細(xì)胞）等多種癌細(xì)胞具有良好的殺滅效果， 同時具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潛力，從而抑制HBV的復(fù)制。Kumar等人研究顯示 Antroquinonol對A549 (腺癌細(xì)胞系）具有強(qiáng)烈的抑制作用，使用12h后其EC50 = 25 y M ; 同時，Antroquinonol可以通過改變PI3K/mT0R蛋白活性和mRNA的表達(dá)，顯著的抑制三種 NSCLS癌細(xì)胞的增殖。
[0004]目前，牛樟芝的人工培養(yǎng)方式主要有三種：牛樟樹椴木栽培或是太空包法獲得子 實(shí)體、利用谷物固態(tài)發(fā)酵法獲得菌絲體培養(yǎng)物以及深層液態(tài)發(fā)酵法獲得菌絲體培養(yǎng)物。雖 然菌絲體中很少含有子實(shí)體標(biāo)志的麥角留烷類三萜化合物，但是其自身含有的特征活性成 分（如Antrodins、安卓奎諾爾等）賦予了菌絲體非常良好的保肝和抗癌等活性功能，同時 還產(chǎn)生了一些新的活性，包括神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等，這使得菌絲體培養(yǎng)物在牛樟 芝資源開發(fā)中占有較為有利的地位。與固態(tài)發(fā)酵相比，深層液態(tài)發(fā)酵法是快速獲得大量菌 絲體產(chǎn)品最有效的途徑，可以快速的形成較大生產(chǎn)規(guī)模。但是牛樟芝深層液態(tài)發(fā)酵的缺點(diǎn) 也非常明顯，其中最大的就是活性產(chǎn)物的種類及產(chǎn)量較低一與固態(tài)發(fā)酵相比，正常發(fā)酵狀 態(tài)下活性產(chǎn)物種類較為少，幾乎不產(chǎn)安卓奎諾爾類化合物，這就使得牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲 體產(chǎn)品的功效較弱，市場競爭力不強(qiáng)。
[0005] 公開號為CN1456661A (發(fā)明名稱：樟芝大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝）、 CN101803528A(-種樟芝菌絲體的新穎培養(yǎng)方法）等專利文獻(xiàn)公開了一系列的通過發(fā)酵 法生產(chǎn)樟芝的細(xì)胞培養(yǎng)方法，但上述文獻(xiàn)中所公開的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物均為樟芝菌絲體或是多 糖，并沒有關(guān)于樟芝菌絲體特征活性產(chǎn)物安卓奎諾爾類化合物的生產(chǎn)方法報道。
[0006] 由于富含生理活性物質(zhì)的樟芝產(chǎn)品的需求與日倶增，急需一種有效的牛樟芝液態(tài) 發(fā)酵方法，有針對性地提高牛樟芝菌體特征活性產(chǎn)物安卓奎諾爾類化合物的含量，以提高 牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體產(chǎn)品的功效，滿足市場的不斷更新發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的，就是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一株牛樟芝菌株及牛樟芝 液態(tài)發(fā)酵方法，可以提高牛樟芝菌絲體中安卓奎諾爾類化合物的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明中的牛樟芝菌株S-29,己于2014年9月9日保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類命名為樟芝，拉丁 文分類命名為Antrodia camphorata，保藏編號為CGMCC No 9590。上述牛棒芝菌株S-29 的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 基于上述牛樟芝菌株的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，包括以下步驟：
[0010] A、以牛樟芝菌株S-29為原料，先在麥芽汁斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)為樟芝斜面菌種；
[0011] B、將樟芝斜面菌種接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)為液態(tài)種子；
[0012] C、將液態(tài)種子接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中添加過氧化氫， 利用過氧化氫氧化脅迫誘導(dǎo)菌絲體合成安卓奎諾爾類化合物。
[0013] 步驟A的培養(yǎng)時間為10-12天，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0014] 步驟B的培養(yǎng)時間為2天，培養(yǎng)溫度為30°C。
[0015] 步驟C的培養(yǎng)時間為5-20天，培養(yǎng)溫度為28°C，過氧化氫在培養(yǎng)至少一天后添加， 添加過氧化氫后再至少培養(yǎng)四天，過氧化氫添加量為5-100mm 〇l/L。
[0016] 步驟C中液態(tài)種子的接種量為5 % -50 % (v/v)。
[0017] 所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源以及一種以上的無機(jī)鹽；所述碳源為可溶 性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、糯米粉或其組合；所述氮源為NH 4C1、胰蛋白胨、黃豆粉、玉 米漿粉、麥芽抽提物、酵母抽提物或其組合；所述無機(jī)鹽為磷酸鹽、硫酸鎂、檸檬酸鹽、氯化 鈉或其組合；碳源的添加量為20-100g/L ;氮源的添加量為2-15g/L ;無機(jī)鹽的添加量為 0. 1-1. Og/L ;液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制完成后于121°C滅菌10_40min，然后冷卻至15-35°C待 用。
[0018] 本發(fā)明的方法能誘導(dǎo)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體產(chǎn)生安卓奎諾爾類化合物。在發(fā)酵過 程中添加過氧化氫進(jìn)行氧化脅迫，促進(jìn)液態(tài)發(fā)酵菌體產(chǎn)生具有良好抗癌功效的活性產(chǎn)物， 其中安卓奎諾爾含量為7-15mg/g菌體，安卓奎諾爾B含量為20-50mg/g菌體。本發(fā)明的發(fā) 酵方法技術(shù)工藝簡單、高效，有著重要的工業(yè)應(yīng)用價值，同時對促進(jìn)牛樟芝其他活性代謝產(chǎn) 物的生產(chǎn)具有一定的啟迪意義。
[0019] 安卓奎諾爾、安卓奎諾爾B等化合物采用高效液相色譜法（HPLC)進(jìn)行分析。取 烘干粉碎的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌粉末〇. 5g，加入60ml乙醇，50°C，振蕩萃取1. 5h，靜置后取 上清經(jīng)過0. 22 ym濾膜微濾，進(jìn)行HPLC分析。分析條件如下：色譜柱：Sepax Amethyst C18(4. 6mmX250mm);流速：lmL/min ;檢測波長：254nm ;流動相 A :水 / 乙酸=100/0. 5， 流動相B :乙腈；洗脫梯度如下：0-10min，流動相B 35 % -50 % ; 10-35min，流動相B 50% -60% ;35-50min，流動相 B 60% -80% ;50-60min，流動相 B 80% -100%。
[0020] 具體實(shí)施方法
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。
[0023] 液態(tài)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨4,玉米漿粉2。
[0024] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨2,玉米漿粉2, K2HP040. 1，MgS040. 1。 所用培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。
[0025] 牛樟芝菌種先在麥芽汁斜面28°C培養(yǎng)12天，然后接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液 態(tài)種子30 °C培養(yǎng)2天之后接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0026] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，pH 5. 0,培養(yǎng)1天后加 入過氧化氫5mmol/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)至5天。用此方法脅迫牛樟芝生產(chǎn)特征活性產(chǎn)物，安卓 奎諾爾含量為2mg/g菌體，安卓奎諾爾B含量為5mg/g菌體。
[0027] 實(shí)施例2 :
[0028] 斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。
[0029] 液態(tài)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨4,玉米漿粉2。
[0030] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖40,胰蛋白胨5,玉米漿粉2, K2HP040 . 3, MgS040 . 3。 所用培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。
[0031] 牛樟芝菌種先在麥芽汁斜面28°C培養(yǎng)12天，然后接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液 態(tài)種子30 °C培養(yǎng)2天之后接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0032] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，pH 5. 0,培養(yǎng)3天后加 入過氧化氫20mmol/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)至10天。用此方法脅迫牛樟芝生產(chǎn)特征活性產(chǎn)物，安 卓奎諾爾含量為l〇mg/g菌體，安卓奎諾爾B含量為37mg/g菌體。
[0033] 實(shí)施例3 :
[0034] 斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。
[0035] 液態(tài)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨4,玉米漿粉2。
[0036] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蔗糖40,黃豆粉5,玉米漿粉2，K2HP0 40 . 3，MgS040 . 3。所用 培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。
[0037] 牛樟芝菌種先在麥芽汁斜面28°C培養(yǎng)12天，然后接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液 態(tài)種子30 °C培養(yǎng)2天之后接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0038] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，pH 5. 0,培養(yǎng)6天后加 入過氧化氫35mmol/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)至15天。用此方法脅迫牛樟芝生產(chǎn)特征活性產(chǎn)物，安 卓奎諾爾含量為13mg/g菌體，安卓奎諾爾B含量為44mg/g菌體。
[0039] 實(shí)施例4 :
[0040] 斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。
[0041] 液態(tài)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨4,玉米漿粉2。
[0042] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖100,胰蛋白胨15,玉米漿粉2, K2HP041. 0， MgS04l. 0。所用培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。
[0043] 牛樟芝菌種先在麥芽汁斜面28°C培養(yǎng)12天，然后接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液 態(tài)種子30 °C培養(yǎng)2天之后接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0044] 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，pH 5. 0,培養(yǎng)10天后加 入過氧化氫100mm〇l/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)至20天。用此方法脅迫牛樟芝生產(chǎn)特征活性產(chǎn)物，安 卓奎諾爾含量為7mg/g菌體，安卓奎諾爾B含量為23mg/g菌體。
[0045] 序列表 <L10>上海理工大學(xué) <120> -株牛樟芝菌株及牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法 <!60> 1 <!70> Patentln version <21()> 1 <211> 1723 <212> DIS八 <213> 牛樟芝菌株 /?oraw ) S-29 <400> 1

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株牛樟芝菌株（Antrodia camphorata)，命名為牛樟芝菌株S-29,其保藏編號為 CGMCC No 9590〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛樟芝菌株，其特征在于：所述牛樟芝菌株S-29的序列如 SEQ ID NO. 1 所示。3. 基于權(quán)利要求1所述牛樟芝菌株的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步 驟： Α、以牛樟芝菌株S-29為原料，先在麥芽汁斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)為樟芝斜面菌種； Β、將樟芝斜面菌種接入液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)為液態(tài)種子； C、將液態(tài)種子接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中添加過氧化氫，利用 過氧化氫氧化脅迫誘導(dǎo)菌絲體合成安卓奎諾爾類化合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于：步驟Α的培養(yǎng)時間為 10-12天，培養(yǎng)溫度為28°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于：步驟B的培養(yǎng)時間為2 天，培養(yǎng)溫度為30 °C。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于：步驟C的培養(yǎng)時間為 5-20天，培養(yǎng)溫度為28°C，過氧化氫在培養(yǎng)至少一天后添加，添加過氧化氫后再至少培養(yǎng) 四天，過氧化氫添加量為5-100mmol/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于：步驟C中液態(tài)種子的接 種量為 5% -50% (v/v)。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于：所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 包括碳源、氮源以及一種以上的無機(jī)鹽；所述碳源為可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、 糯米粉或其組合；所述氮源為NH 4C1、胰蛋白胨、黃豆粉、玉米漿粉、麥芽抽提物、酵母抽提 物或其組合；所述無機(jī)鹽為磷酸鹽、硫酸鎂、檸檬酸鹽、氯化鈉或其組合；碳源的添加量為 20-100g/L ;氮源的添加量為2-15g/L ;無機(jī)鹽的添加量為0. 1-1. Og/L ;液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配 制完成后于121°C滅菌10_40min，然后冷卻至15-35°C待用。
【文檔編號】C12R1/645GK105820956SQ201510003264
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月4日
【發(fā)明人】夏永軍, 艾連中, 許贛榮, 王光強(qiáng), 楊昳津
【申請人】上海理工大學(xué)