一種攜帶ctag1b/ny-eso-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種攜帶CTAG1B/NY?ESO?1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體，其構(gòu)建方法，包括以下步驟：（1）體外克隆CTAG1B/NY?ESO?1基因；（2）將pscAAV?MCS載體和克隆基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進(jìn)行雙酶切，然后DNA連接得攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV?CTAG1B；（3）測序鑒定。本發(fā)明所用腫瘤抗原基因有表達(dá)范圍廣、特異性高的特點(diǎn)；自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒scAAV6有安全性高、侵染能力強(qiáng)的特點(diǎn)；基于pscAAV?CTAG1B重組載體的細(xì)胞免疫治療能有效緩解CTAG1B/NY?ESO?1抗原陽性腫瘤患者病情，且副作用小。
【專利說明】
一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相 關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于重組腺相關(guān)病毒載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1 腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法和該載體在抗CTAG1B/NY-ES0-1抗 原陽性腫瘤細(xì)胞免疫療法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是全球范圍內(nèi)危害人們身體健康和生命的重大疾病之一。腫瘤治療方式主要 包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療以及免疫治療等，這些治療方式能一定程度抑制腫瘤的生 長，但是通常也伴隨著一定的副作用。對于靶向治療和免疫治療來說，靶點(diǎn)（即腫瘤抗原）的 選取尤為重要，關(guān)乎到療效的高低和副作用的大小程度。CTAG1B/NY-ES0-1是一種癌/睪丸 抗原（cancer-testis antigen)，其基因位于X染色體上Xq28區(qū)域。但CTAG1B/NY-ES0-1僅在 睪丸組織中表達(dá)，而在其他成體組織中不表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，由于表觀遺傳因素的改變而 導(dǎo)致CTAG1B/NY-ES0-1的異常表達(dá)。NY-ES0-1是在1990s年代末由康奈爾大學(xué)（位于紐約， NewYork)的研究人員在食管癌(esophageal cancer)中發(fā)現(xiàn)的，并因此而命名。除了在食管 癌中表達(dá)外，CTAG1B/NY-ES0-1在黑色素瘤、滑膜肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌 以及膀胱癌等多種腫瘤中均有表達(dá)。CTAG1B/NY-ES0-1的表達(dá)量還與腫瘤惡性程度相關(guān)，并 且可作為腫瘤治療預(yù)后的指標(biāo)之一。
[0003] CTAG1B/NY-ES0-1是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)，它廣泛并且特異地表達(dá)于多 種腫瘤組織中，同時它還具有良好的免疫原性。Jager等在黑色素瘤腫瘤患者體內(nèi)檢測到了 NY-ES0-1的特異性抗體，并從外周血中篩選到了能夠特異識別NY-ES0-1:157-165，157- 167和155-163表位的CD8+T細(xì)胞株。一項臨床試驗表明使用NY-ES0-1:157-165,157-167和 155-163肽段作為疫苗能夠誘導(dǎo)抗原特異性的CD8+T細(xì)胞，并抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而 針對NY-ES0-1特征性抗原表位的疫苗具有一定的局限性，治療效果也十分有限。Hunder等 發(fā)明了一種體外分離和擴(kuò)增特異性靶向NY-ES0-1的自體CD4+T細(xì)胞的技術(shù)，并成功用于治 療了一例復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤腫瘤患者。該技術(shù)利用NY-ES0-1:157-170表位制成的 肽段激活DC細(xì)胞，然后DC細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞。該方法的缺點(diǎn)在于： 1、抗原肽段的半衰期有限，使用抗原段激活DC細(xì)胞需要反復(fù)添加;2、抗原肽段誘導(dǎo)的活化T 細(xì)胞多樣性有局限，與體內(nèi)天然存在的NY-ES0-1特異性的T細(xì)胞有差異。Rosenberg等研發(fā) 了靶向NY-ES0-1的TCR-T細(xì)胞免疫治療方法，將特異識別NY-ES0-1:157-165的TCR基因克隆 至慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，然后制備病毒感染T細(xì)胞，通過基因工程的手段改造 T細(xì)胞 使其表達(dá)特異性的TCR受體，該方法在臨床試驗中也取得了一定的進(jìn)展。但是TCR-T細(xì)胞免 疫治療具有MHC限制性的特點(diǎn)，即腫瘤患者必須是NY-ES0-1和HLA-A*0201雙陽性才能使用 該治療方式。CTAG1B/NY-ES0-1是一個很好的靶點(diǎn)，但是上述的靶向該抗原的免疫治療方法 都有值得改進(jìn)的地方。
[0004]重組腺相關(guān)病毒(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主 細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞）、免疫源性低、在體內(nèi)表達(dá)外源基因時間長等特點(diǎn)，被視為 最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。經(jīng)過多年的研究，重組腺相關(guān)病毒的生物學(xué)特性己被深入 了解，尤其是其在各種細(xì)胞、組織和體內(nèi)實(shí)驗中的應(yīng)用效果方面已經(jīng)積累了許多資料。按照 中和血清類型的不同，重組腺相關(guān)病毒可分為11種血清型，不同血清型的重組腺相關(guān)病毒 表現(xiàn)出不同的組織侵染能力。例如AAV2具有廣譜的組織嗜性，如肝、肺、肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)等， 但侵染效率一般;而AAV7更傾向于在骨骼肌中的侵染，而不能侵染其他組織。對于DC細(xì)胞的 侵染而言，AAV2、AAV6的使用均有報道，但AAV6的侵染效率更勝一籌。重組腺相關(guān)病毒是一 種單鏈DNA病毒，在宿主細(xì)胞內(nèi)，其單鏈DNA需要首先轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA才能進(jìn)行表達(dá)，因而限 制了其表達(dá)效率。自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒（self-complementary，scAAV)則克服了這一障 礙，通過在載體右端的IRT(Inverted Terminal Repeats)區(qū)域引入特定的缺失和突變，從 而在病毒包裝過程中可以形成雙鏈的基因組。
[0005] 但將CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因用于構(gòu)建自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體并將其 用于抗CTAG1B/NY-ES0-1陽性腫瘤細(xì)胞免疫治療中未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗 原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用了 scAAV6-DC-CTL細(xì) 胞免疫治療技術(shù)，將腫瘤抗原基因 CTAG1B/NY-ES0-1輸入到樹突狀細(xì)胞(DC)中，通過DC細(xì)胞 和T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)出抗原特異性的殺傷性T細(xì)胞(CTL)，該方法安全性高，副作用小，靶向 性強(qiáng)，能有效殺傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤細(xì)胞。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
[0008] 一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方 法，包括以下步驟：
[0009] (1)體外克隆 CTAG1B/NY-ES0-1 基因；
[0010] (2)將pscAAV-MCS載體和CTAG1B/NY-ES0-1基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，得到攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV-CTAGIB; [0011] (3)測序鑒定。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟（1)中克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的方法為:從H1299肺癌細(xì)胞株中 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總c D N A，然后以c D N A為模板，在正義鏈引物5 ' - ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3 '（ SEQID-2)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到所述的CTAG1B/ NY-ES0-1基因。
[0013] 進(jìn)一步地，上述所說的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)10y L、dNTP Mixture(2.5mM each)4yL、Primer F lyL、Primer R lyL、cDNA 2yL、Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5yL、dH2〇 31.5yL〇
[0014] 進(jìn)一步地，上述所說的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：98°C預(yù)變性5分鐘，接著98°C變性20 秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟⑵中酶切反應(yīng)體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)粒/CTAG1B/NY-ES0-1基 因 ，lyL EcoR I，lyL XbaI，5yL 10XNEB Buffer以及適量去離子水，總體積為50yL;反應(yīng)條 件為:37 °C，1.5小時。
[0016] 上述任一項構(gòu)建方法構(gòu)建出的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組 腺相關(guān)病毒載體。
[0017] 上述所述的一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載 體在CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細(xì)胞免疫療法方面的應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步地，攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體與 突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT和pHelper按摩爾比為1:1:1，共同用于CTAG1B/NY-ES0-1抗 原陽性腫瘤的細(xì)胞免疫療法。
[0019] 進(jìn)一步地，所述的突變型輔助載體PAAV6-RC6MUT的構(gòu)建方法為：將野生型載體 PAAV6-RC6上的四個位點(diǎn)T251，T492，S563和S663分步突變?yōu)槔i氨酸，得突變性輔助載體 pAAV6-RC6MUT即pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V;其中反應(yīng)體系為lOxReaction buffer(Mg2+Plus)5yL,lOng/yL Sample plasmid 2yL,10pmol/yL primer F lyL,lOpmol/μ L primer R lyL,dNTP mixture(2.5mM each)，lyL Muta-direct Enzyme,38yL dH2〇； 反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性30秒，95 °C變性30秒，55 °C退火60秒，72°C延伸8分鐘，共15個循環(huán)， 最后4°C保存5分鐘；點(diǎn)突變反應(yīng)所用引物如下：
[0020] T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
[0021 ] T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
[0022] T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
[0023] T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
[0024] S563V-F:TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7);
[0025] S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
[0026] S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
[0027] S663V-R:GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG (SEQID-10)。
[0028] 將攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體用于抗腫瘤 細(xì)胞免疫治療，治療過程為:將重組載體pscAAV-CTAGIB、突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT和 pHelper共轉(zhuǎn)染到293AAV細(xì)胞中制備自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒（scAAV6)，再使用scAAV6侵染 單核樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞），感染復(fù)數(shù)Μ0Ι為20，OOOvgs/ce 11，48h后重復(fù)侵染一次，然后將DC 細(xì)胞與T細(xì)胞按數(shù)量比為1:10共培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗腫瘤活性T細(xì)胞(CTL)，一周后再 用scAAV6侵染過的DC細(xì)胞去刺激T細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)大量擴(kuò)增，并按照l-3X109cells/m2對 CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤患者進(jìn)行回輸治療。
[0029]本發(fā)明提供的一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒 載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明的腫瘤抗原基因 CTAG1B/NY-ES0-1具有表達(dá)范圍廣、特異性高的特點(diǎn)， 是很好的免疫治療靶點(diǎn)。
[0031] (2)本發(fā)明的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒SCAAV6具有安全性高、侵染能力強(qiáng)的特點(diǎn)，尤 其對于DC細(xì)胞具有很好的嗜性。
[0032] (3)本發(fā)明的靶向CTAG1B/NY-ES0-1的scAAV6-DC-CTL細(xì)胞免疫治療方法能有效殺 傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤細(xì)胞，能有效緩解CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤患者 的病情，且副作用很小。
【附圖說明】
[0033] 圖1為PCR克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的瓊脂糖電泳圖。
[0034] 圖2為pscAAV-MCS質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035] 圖3為重組載體pscAAV-CTAGIB的PCR鑒定結(jié)果圖。
[0036]圖4為重組載體pscAAV-CTAGIB的雙酶切鑒定結(jié)果圖；其中泳道1為載體pscAAV- MCS酶切結(jié)果圖，泳道2為重組載體pscAAV-CTAGIB的酶切結(jié)果圖。
[0037]圖5為定量PCR測定scAAV6病毒基因組滴度的實(shí)驗結(jié)果圖。
[0038]圖6為scAAV6-DC-CTL細(xì)胞免疫治療的流程圖。
[0039]圖7為scAAV6侵染樹突狀細(xì)胞的效率分析圖，其中A為無病毒陰性對照，B為野生型 scAAV6，C 為突變型 scAAV6。
[0040]圖8為樹突狀細(xì)胞表面分子⑶80、⑶86流式分析結(jié)果圖。
[00411圖9為流式細(xì)胞儀測定T細(xì)胞活化標(biāo)志物0X40、4-1BB的分析結(jié)果圖。
[0042]圖10為CTL細(xì)胞體外殺傷H1299腫瘤細(xì)胞的分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 實(shí)施例1 pscAAV-CTAGIB重組載體的構(gòu)建及鑒定
[0044] -、材料及來源
[0045] l、pscAAV-MCS質(zhì)粒:從美國Cell Biolabs公司購買。
[0046] 2、H1299細(xì)胞:從中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫購買。
[0047] 3、基因擴(kuò)增引物:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CTAG 1B/NY-E SO-1基因的mRNA序列設(shè)計(NM_ 001327.2)。
[0048] 二、攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建
[0049] 本實(shí)施例所提供的構(gòu)建方法，是使用限制性內(nèi)切酶將載體的多克隆位點(diǎn)切開，再 運(yùn)用DNA連接技術(shù)將CTAG1B/NY-ES0-1基因與載體進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pscAAV-CTAGIB重組 載體，具體過程包括以下步驟：
[0050] (1)獲取總cDNA，具體方法為:采用Trizol試劑(Life technology公司）提取H1299 細(xì)胞的總RNA，首先離心收集細(xì)胞（1 X 107cells)，加入lmLTrizol進(jìn)行提取，RNA沉淀用50yL DEPC-H20溶解，并測定其濃度；
[0051 ] 以lyg RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20μυ為：lyL 01igo(dT)i8， 2yL dNTP Mix(10mM each),lyL Revert Aid M-MuL V,lyL RNase Inhibitor,4yL 5X Reaction Buffer，所用試劑盒為Thermo Scientifi公司購買，反應(yīng)條件為42°C，1小時，得 到cDNA，-20°C保存待用；
[0052] (2)PCR克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因，具體方法為：以上述cDNA為模板，在引物1 (SEQID-1)5 '-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3 ' 和弓丨物2(SEQID-2)5 '- ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3'的引導(dǎo)下進(jìn)行RCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到CTAG1B/NY-ES0-1 基 因；
[0053] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10yL 5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)，4yL dNTP Mixture (2.5mM each),lyL Primer F,lyL Primer R,2yL cDNA,0.5yL Prime STAR HS DNA Polymerase，31·5uL dH2〇;
[0054] PCR擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性5分鐘，98°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒， 共30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂 糖凝膠電泳，在680bp的位置出現(xiàn)了一條特異性條帶(如圖1所示），將該目的條帶進(jìn)行回收 純化處理；
[0055] (3)構(gòu)建pscAAV-CTAGIB重組載體:分別對pscAAV-MCS質(zhì)粒(如圖2所示)和CTAG1B/ NY-ES0-1基因進(jìn)行限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，純化后進(jìn)行酶連反應(yīng)，所用限制性內(nèi)切酶為EcoR I ?HF和Xbal (購自NEB公司），酶切反應(yīng)體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)?；駽TAG1B/NY-ES0-1基因， lyL EcoR I?HF，lyL XbaI，5yL 10XNEB Buffer以及適量去離子水，總體積為50yL;反應(yīng)條 件為：37°C，1.5小時，反應(yīng)結(jié)束后使用Axygen? Axyprep? PCR Clean-up Kit試劑盒進(jìn)行 純化處理，并測定濃度，最后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為：lyL T4DNA Ligase (購自 TaKaRa公司），2yL 10 X ReactionBuffer，0 · 3pmol CTAG1B/NY-ES0-1基因片 段，0.03pmol pscAAV-MCS質(zhì)粒片段，以及適量的去離子水，總體積為20yL;反應(yīng)條件為16 。。，過夜；
[0056] (4)轉(zhuǎn)化及涂板:將上述連接產(chǎn)物5yL導(dǎo)入至100yL感受態(tài)細(xì)菌Τ0Ρ10(天根生物科 技公司）中，冰浴30分鐘，再42°C熱激90秒，然后冰上放置2分鐘，最后加入400yL LB培養(yǎng)基， 置于搖床中復(fù)蘇45分鐘，轉(zhuǎn)速為150r/min;最后取100yL菌液涂在含100yg/mL氨芐青霉素 (Amp)的LB平板上，37 °C細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；
[0057] (5)質(zhì)粒提?。禾羧慰寺∮?mL LB/Amp培養(yǎng)基，37°C搖床中培養(yǎng)16小時（轉(zhuǎn)速 200r/min)，然后收集細(xì)菌，使用E.Z.N.A.?End〇-Free Plasmid Mini KitI試劑盒提取質(zhì) 粒。
[0058] 三、重組載體的鑒定
[0059] 1、PCR鑒定：以提取的質(zhì)粒為模板，使用上述提到的引物1 ( SEQID-1)和引物2 (SEQID-2)進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物中出現(xiàn)CTAG1B/NY-ES0-1特異性片段則表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成 功。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件與上述提及的一致，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%)， 觀察在680bp處是否出現(xiàn)一條特異性條帶(如圖3所示）。
[0060]由圖3可知，在680bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，說明重組載體構(gòu)建成功。
[0061 ] 2、酶切鑒定：將提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，所用限制性內(nèi)切酶為EcoR 1@@和 Xbal，反應(yīng)體系和條件如上所述。
[0062]結(jié)果如圖4所示，重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)了兩條條帶，一個為質(zhì)粒(約3.7kb)，另一個 為CTAG1B/NY-ES0-1 片段(680bp)。
[0063] 3、DNA測序鑒定:將提取的質(zhì)粒送樣測序，測序引物為：
[0064] CMV-F:5，-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3，（SEQID-11);
[0065] Reverse:5，-TAAAGCATCGAGATCGCAGG-3，（SEQID-12)〇
[0066] 使用NCBI Blast進(jìn)行序列比對，測序得到的序列與CTAG1B基因序列100%吻合，進(jìn) 一步證明構(gòu)建的pscAAV-CTAGIB重組載體是正確的。
[0067] 實(shí)施例2自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒的制備
[0068] 一、材料及來源
[0069] 1、實(shí)施例1中構(gòu)建的pscAAV-CTAGIB重組載體。
[0070] 2、輔助載體 pAAV6-RC6MUT 和 pHe lper:購自 Ce 1 IB i o labs 公司。
[0071 ] 3、293AAV細(xì)胞:購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。
[0072] 4、Po lye thy lenimine (PEI):購自Poly sciences公司（Cat#23966)。
[0073] 5、0PTI_MEM培養(yǎng)基：購自Life technology公司。
[0074] 6、0ptiPrep? Density Gradient Medium(鵬克沙醇）和Benzonase:購自Sigma公 司。
[0075] 二、自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒(scAAV6)的制備及鑒定
[0076] 制備方法是將重組載體pscAAV-CTAGIB和突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT、pHelper 共轉(zhuǎn)染到293AAV細(xì)胞中，收集病毒顆粒并純化鑒定，具體過程包括以下步驟：
[0077] (1)突變型輔助載體 pAAV6-RC6MUTS 卩 pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V的構(gòu) 建，其具體方法是:將野生型載體PAAV6-RC6上的四個位點(diǎn)T251，T492，S563和S663分步突變 為結(jié)?氨酸，反應(yīng)體系為5yL lOxReaction buffer，2yL Sample plasmid(10ng/yL，total 20ng),lyL primer(F)(10pmol/yL),lyL primer(R)(10pmol/yL),2yL dNTP mixture(each 2.5mM)，lyL Muta-direct Enzyme，38yL dH20;反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性30秒，95°C變性30 秒，55 °C退火60秒，72 °C延伸8分鐘，共15個循環(huán);最后4°C保存5分鐘；其中點(diǎn)突變反應(yīng)所用 引物如下：
[0078] T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
[0079] T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
[0080] T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
[0081 ] T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
[0082] S563V-F:TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7);
[0083] S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
[0084] S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
[0085] S663V-R:GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG(SEQID-10)。
[0086] (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:使用聚醚酰亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染法將重組載體pscAAV-CTAGIB、突變型輔 助載體pAAV6-RC6MUT和pHelper共轉(zhuǎn)染到293AAV細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染前24小時，293AAV細(xì)胞傳代至 15cm dish中（密度3 X 105cells/mL)，培養(yǎng)基（DMEM高糖，購自Hyclone)體積為22 · 5mL(不 含抗生素）；轉(zhuǎn)染前3-4小時換液(20mL);轉(zhuǎn)染體系包括:在1.7mL EP管中加入500yL 0ΡΤΙ- MEM(37°C預(yù)熱），然后按摩爾比1:1:1的比例加入如下質(zhì)粒，13yg pHelper，8yg突變型輔助 載體pAAV-RC6MUT，5yg重組載體pscAAV-CTAGIB，然后再加入 110yL PEI(lmg/mL)，PEI與DNA 的比例為4:1 (v: w);將DNA/PEI混合溶液簡單地漩渦震蕩混勻，然后室溫放置15分鐘后將 DNA/PEI混合溶液逐滴加入培養(yǎng)皿中，并輕輕的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以便轉(zhuǎn)染混合物能均勻的分布 到培養(yǎng)基中（DMEM高糖，購自Hyclone);
[0087] (3)病毒收集:將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞置于C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72小時，然后收集細(xì)胞， 在乙醇+干冰和37 °C水浴中反復(fù)凍融三次，在細(xì)胞裂解液中加入核酸酶Benzonase (終濃度 50U/mL)，37°C孵育30分鐘;3700g離心20分鐘(4°C)收集上清，即為病毒粗提液；
[0088] (4)病毒的純化:使用不連續(xù)的碘克沙醇密度梯度離心法(iodixanol gradients) 純化病毒粗提液;402，000g離心1小時(4°C )，收集病毒濃縮層液體;使用肝素親和層析法進(jìn) 一步純化scAAV6;
[0089] (5)病毒的鑒定:通過定量PCR的方法鑒定SCAAV6的顆粒數(shù)(viral genomes，vgs)。 以pscAAV-CTAGIB重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定質(zhì)粒濃度并計算拷貝數(shù):拷貝數(shù)(Copies/yL) =質(zhì)粒濃度(ng/yL)X10-9\6.02\ 1023(阿伏伽德羅常數(shù))/質(zhì)粒分子量。以107、106、10 5和 1〇4拷貝數(shù)質(zhì)粒作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算SCAAV6的基因組滴度。所用引物為：
[0090] 正義鏈引物：5'-GAGTGGCCAACTCCATCACT-3'（SEQID-13) ;
[0091] 反義鏈引物：5'-ACTCCCATTGACGTCAATGG-3'（SEQID-14)。
[0092] 如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線能很好地擬合拷貝數(shù)和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(CT)，而本發(fā)明的scAAV6 樣品的Ct值為17.9，由此可計算出其拷貝數(shù)為7.6\101()(樣品稀倍數(shù)為106)。
[0093] 實(shí)施例3 pscAAV-CTAGIB重組載體導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞的腫瘤殺傷實(shí)驗
[0094] 一、材料及來源
[0095] 1、自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒(scAAV6):按實(shí)施例2進(jìn)行制備。
[0096] 2、AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基:購自Lonza公司。
[0097] 3、細(xì)胞因子:GM-CSF、IL-4、IL-2 和 TNFa，均購自 Peprotech 公司。
[0098] 4、CD3抗體(0KT3):購自Life Technology公司。
[0099] 5丄080、0)86、(《40和4-188流式檢測抗體：購自68丨〇8(^61?^公司。
[0100] 二、scAAV6-CTAG1B侵染樹突狀細(xì)胞
[0101] 如圖6所示，本實(shí)施例pscAAV-CTAGIB重組載體導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞的腫瘤殺傷實(shí)驗的 整個過程包括以下步驟：
[0102] 1、取腫瘤患者外周血50-150mL，使用淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個核細(xì)胞 (PBMC)，使用Am-V培養(yǎng)基(含10%FBS)重懸，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時；
[0103] 2、將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，PBS洗滌三次，貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞 (monocyte);懸浮細(xì)胞即淋巴細(xì)胞，使用含IL-2(20IU/mL)和0KT3(100ng/mL)的A頂-V培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0104] 3、在單核細(xì)胞中加入制備好的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒(感染復(fù)數(shù)M0I:20,000vgs/ cell)，同時加入 GM-CSF(50ng/mL)和 IL-4(100ng/mL)，37°C 培養(yǎng) 4 小時；
[0105] 4、去除步驟3 中舊的培養(yǎng)基，補(bǔ)充含 GM-CSF(50ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和 TNFa (50ng/mL)的A頂-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5天，即可收獲成熟的樹突狀細(xì)胞。
[0106] 使用SCAAV6-GFP侵染樹突狀細(xì)胞進(jìn)行侵染效率分析，結(jié)果如圖7所示，熒光顯微鏡 拍照顯示突變型scAAV6的侵染效率為70%，而野生型scAAV6的侵染效率為30%，野生型 scAAV6具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
[0107] 5、將成熟的樹突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)(DC細(xì)胞與T細(xì)胞的數(shù)量比為1:10)，培 養(yǎng)基為含IL_2(20IU/mL)的A頂-V;7天后再用scAAV6侵染過的DC細(xì)胞去刺激T淋巴細(xì)胞；
[0108] 6、樹突狀細(xì)胞表面分子CD80、CD86的檢測，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，以確定 樹突狀細(xì)胞的功能。
[0109] 如圖8所示，樹突狀細(xì)胞表面⑶80、CD86的表達(dá)均顯著升高，陽性率分別為76.2% 和79.3% 〇
[0110] 三、細(xì)胞毒性τ淋巴細(xì)胞(CTL)體外殺傷實(shí)驗
[0111] 1、成熟的樹突狀細(xì)胞與τ淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)(細(xì)胞數(shù)量比1:10)結(jié)束后，使用流式細(xì) 胞儀分析細(xì)胞表面0X40、4-1BB分子的表達(dá)性。
[0112] 如圖9所示，流式測定的結(jié)果為表面分子(^40、4-188的表達(dá)陽性率分別59.2%、 49.1%，這表明樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，可刺激T細(xì)胞的激活。
[0113] 2、使用51Cr(鉻-51)釋放實(shí)驗方法檢測CTL細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后腫瘤 細(xì)胞的死亡率。具體實(shí)驗步驟為：
[0114] A、標(biāo)記靶細(xì)胞:取培養(yǎng)對數(shù)生長期的靶細(xì)胞(H1299)4X106/mL，加入100-200uCi51Cr，37°C水浴2小時，每隔15min振搖一次;然后用含5%FBS的RPMI-1640(購自Hyclone)培 養(yǎng)液洗滌三次，除去游離的51Cr;
[0115] B、CTL與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)：標(biāo)記后的靶細(xì)胞按照lX103/well的密度鋪在96孔板 中，然后加入CTL細(xì)胞(CTL細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞數(shù)量比為10:1或20:1)，37°C5 %C02培養(yǎng)，共培養(yǎng) 時間為4小時(數(shù)量比為10:1時)或6小時(數(shù)量比為20:1時）；
[0116] C、測定:每孔吸出50yL培養(yǎng)上清置于檢測管中，在γ-計數(shù)儀上測定上清液的每分 鐘放射性活性(cpm值）；殺傷活性=(實(shí)驗孔cpm平均值-自然釋放孔cpm平均值)/(最大釋放 孔cpm平均值-自然釋放孔cpm平均值）；
[0117] 如圖10所示，使用scAAV6-DC-CTL可有效殺傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的H1299 細(xì)胞，CTL和腫瘤細(xì)胞數(shù)量比為10:1和20:1時對應(yīng)的殺傷率分別為63.7%和81.1 %。
【主權(quán)項】
1. 一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方 法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 體外克隆 CTAG1B/NY-ES0-1基因； (2) 將pscAAV-MCS載體和CTAG1B/NY-ES0-1基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進(jìn) 行雙酶切，然后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，得到攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV-CTAGIB; (3) 測序鑒定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病 毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1)中克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的方法為：從H1299 肺癌細(xì)胞株中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，然后以cDNA為模板，在正義鏈引物5'-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3 ' 和反義鏈引物5 ' -ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3 ' 的 引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到所述的CTAG1B/NY-ES0-1基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病 毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:含Mg 2+的5xPrime STAR Buffer 10μ L、濃度為2.5mM的dNTP Mixture 4yL、Primer F lyL、Primer R lyL、cDNA 2yL、Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5yL、dH2〇31.5yL〇4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病 毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:98 °C預(yù)變性5分鐘，98 °C變性20秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病 毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2)中酶切反應(yīng)體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)粒/ CTAG1B/NY-ES0-1 基因 ，lyL EcoR I，lyL XbaI，5yL10X NEB Buffer以及適量去離子水，總 體積為50yL;反應(yīng)條件為:37°C，1.5小時。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建出的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原 基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補(bǔ)型重組腺相關(guān)病 毒載體在CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細(xì)胞免疫療法方面的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自 補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載體與突變型輔助載體pAAV6-RC6 MUT和pHelper按摩爾比為1:1:1，共 同用于CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細(xì)胞免疫療法。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT的構(gòu) 建方法為:將野生型載體PAAV6-RC6上的四個位點(diǎn)T251，T492，S563和S663分步突變?yōu)槔i氨 酸，得到突變性輔助載體pAAV6-RC6 MUT;其中反應(yīng)體系為含Mg2+的lOxReaction buffer 5yL， lOng/yL Sample plasmid 2yL, 10pmol/yL primer F lyL, 10pmol/yL primer R lyL，濃度 為2.5mM的dNTP mixture 2yL，lyL Muta-direct Enzyme，38yL dH2〇;反應(yīng)條件為：95°C預(yù) 變性30秒，95°C變性30秒，55°C退火60秒，72°C延伸8分鐘，共15個循環(huán);最后4°C保存5分鐘； 點(diǎn)突變反應(yīng)所用引物如下： T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC； T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG； T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC； T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG； S563V-F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG； S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA； S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC； S663V-R：GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCT 〇
【文檔編號】C12N15/66GK105838738SQ201610179322
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】申重陽, 陳勇軍, 王仲
【申請人】成都康景生物科技有限公司