一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，屬于植物細(xì)胞工程和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。將酸棗葉片接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)2～4d，得到外植體；將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體，得到被侵染的外植體；將被侵染的外植體置于WPM固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～4d；將暗培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)入WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，共暗培養(yǎng)14～16d后移至光下，在含0.1mg/L吲哚乙酸和0.5mg/L赤霉素的WPM培養(yǎng)基中進(jìn)行葉片再生的伸長培養(yǎng)，得到不定芽，將不定芽轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，得到遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株。本發(fā)明提供的酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系方法為酸棗提供了合適的再生體系，且轉(zhuǎn)化頻率高，重復(fù)性高，有利于酸棗的遺傳改良。
【專利說明】
一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酸率(Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosa)為鼠李科率屬植物，是中國率的原生種，在我國分布十分廣闊。酸棗花期長，是良好的蜜源植物，種仁可入藥;棗果營養(yǎng)價(jià)值高，含有鉀、鈉、鐵、鋅、磷、砸等多種微量元素;更重要的是酸棗中含有大量的維生素C，其含量高于普通紅棗、柑橘、蘋果、葡萄等水果，因而備受消費(fèi)者親睞，在果樹的生產(chǎn)和銷售中具有重要價(jià)值。然而，酸棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6-7d。若不能及時(shí)攻克以上難題，則會(huì)大大限制酸棗的價(jià)值利用;此外，酸棗樹花小、人工去雄難、坐果率低且胚敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，使其雜交育種非常困難，在短期內(nèi)無法實(shí)現(xiàn)定向育種的目標(biāo)。
[0003]隨著基因工程技術(shù)在果樹育種上的廣泛應(yīng)用，以及棗樹全基因組測(cè)序的完成，棗樹育種研究也全面進(jìn)入基因水平。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棗樹育種工作方面雖然取得了一些進(jìn)展，但體系仍不夠成熟，而且同一品種的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法也有較大差異，重復(fù)性差，具有很大局限性。
[0004]由于棗樹組織培養(yǎng)植株再生難度較大，缺少合適的再生體系，與其他果樹遺傳轉(zhuǎn)化相比進(jìn)展緩慢，截至目前有幾例相關(guān)研究報(bào)道。尹美強(qiáng)研究了異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)鏃椙o段的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了少量轉(zhuǎn)基因植株(尹美強(qiáng).根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)鏃椀倪z傳轉(zhuǎn)化研究[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002)。孟輝利用以沾化冬棗為材料將als和be tA基因轉(zhuǎn)入冬棗莖尖，也得到一些轉(zhuǎn)基因植株(孟輝.沾化冬棗基因工程改良的基礎(chǔ)研究[D].山東大學(xué)，2005)。郝征(2012)和黃建(2006)等人利用棗樹葉片進(jìn)行了抗蟲和抗鹽性方面的研究，但轉(zhuǎn)化率均不是很高(郝征.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012)和(黃建.農(nóng)桿菌介導(dǎo)S6PDH基因轉(zhuǎn)化棗樹(Zyziphus jujuba Mill.)的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006)。相對(duì)其他果樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究，棗樹的轉(zhuǎn)基因工作仍處于探索階段，對(duì)于利用酸棗葉片為受體轉(zhuǎn)入延緩衰老相關(guān)基因的研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法。本發(fā)明提供的方法轉(zhuǎn)化頻率高，重復(fù)性高，有利于酸棗的遺傳改良，為酸棗提供了合適的再生體系O
[0006]本發(fā)明提供了一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，包括以下步驟:
[0007]I)將酸棗葉片接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)2?4d，得到外植體，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括0.8?3.0mg/L噻苯隆、0.2?0.5mg/L吲哚丁酸、28?32g//L蔗糖和5?7g/L瓊脂；
[0008]2)將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染所述步驟I)得到的外植體，得到被侵染的外植體；
[0009]3)將所述步驟2)得到的被侵染的外植體置于WPM固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2?4d，所述WPM固體培養(yǎng)基包括0.5?2.0mg/L噻苯隆和0.25?0.4mg/L吲哚丁酸；
[0010]4)將所述步驟3)暗培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)入WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)14?16d，所述WPM固體篩選培養(yǎng)基含有0.8?2.5mg/L噻苯隆、0.2?0.4mg/L吲哚丁酸、180?220mg/L頭孢霉素和15?25mg/L卡那霉素；
[0011]所述暗培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入WPM伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行葉片再生的伸長培養(yǎng)，得到不定芽，所述WPM伸長培養(yǎng)基含有0.lmg/L吲哚乙酸和0.5mg/L赤霉素的；
[0012]5)將所述步驟4)得到的不定芽擴(kuò)繁，得到遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株。
[0013]優(yōu)選的是，所述步驟2)中侵染的時(shí)間為1?20min。
[0014]優(yōu)選的是，所述步驟4)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的光周期為12?16h/d，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為30?40d，所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括0.08?0.12mg/L卩引噪丁酸、0.3?0.6mg/L赤霉素、180?220mg/L頭孢霉素和15?25mg/L卡那霉素。
[0015]優(yōu)選的是，所述步驟5)的不定芽擴(kuò)繁具體為:待不定芽的莖長為15?20_時(shí)，將不定芽轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，所述MS培養(yǎng)基包括0.8?1.2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.3?0.6mg/L卩引噪丁酸和18?22mg/L卡那霉素。
[0016]優(yōu)選的是，所述步驟I)、3)、4)和5)中的培養(yǎng)溫度獨(dú)立地選為25±2°C。
[0017]優(yōu)選的是，所述步驟I)前還包括:將酸棗葉片進(jìn)行前處理；
[0018]所述前處理的過程具體為:剪下酸棗組培苗形態(tài)學(xué)自上而下第3?5枚葉片，將剪下的葉片作為轉(zhuǎn)化材料；
[0019]將所述轉(zhuǎn)化材料沿葉片中脈垂直方向橫切2?4個(gè)傷口，切斷主脈但不切斷葉片；
[0020]所述步驟I)中的接種以近軸端接觸培養(yǎng)基方式進(jìn)行。
[0021]優(yōu)選的是，所述農(nóng)桿菌菌液的制備方法包括以下步驟:
[0022]將農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至OD6qq為0.5?0.7，所述YEB液體培養(yǎng)基包含40?55mg/L利福平、40?55mg/L頭孢霉素和40?55mg/L卡那霉素；
[0023]以0.02?0.05%的接種量將所述暗培養(yǎng)得到的菌液接種于不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6qq為0.4?1.0;
[0024]將所述OD6qq為0.4?1.0的菌液與150?300ymol/L的乙酰丁香酮混合，繼續(xù)培養(yǎng)
0.8?1.5h，得到農(nóng)桿菌菌液。
[0025]優(yōu)選的是，所述步驟5)后還包括:將所述遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株進(jìn)行分子檢測(cè)；
[0026]所述分子檢測(cè)包括以下步驟:
[0027]利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)是否有目的基因條帶，確定目的基因DNA的整合情況。
[0028]上述技術(shù)方案所述的分子檢測(cè)后還包含:將所述檢測(cè)后的植株進(jìn)行小苗生根和移栽；
[0029]所述小苗生根和移栽的過程具體為:將所述檢測(cè)后的植株繼續(xù)培養(yǎng)，待長至株高為1.5?2cm后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根;根生長至2?3cm后，移入營養(yǎng)土中繼續(xù)生長。
[0030]本發(fā)明提供的一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，葉片轉(zhuǎn)化頻率高，重復(fù)性高，由于通過葉片直接再生不定芽方式避免了經(jīng)愈傷途徑有可能發(fā)生的變異，得到的轉(zhuǎn)基因酸棗植株既具備酸棗原有的優(yōu)良特征，又具備所轉(zhuǎn)基因的功能，本發(fā)明方法有利于酸棗的遺傳改良，為酸棗提供了合適的再生體系。
【附圖說明】
[0031 ]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的不定芽的萌發(fā)和生長狀態(tài)圖；
[0032]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的不同農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響的柱狀圖；
[0033 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的農(nóng)桿菌菌株中的表達(dá)載體pBI 121-SPDS的圖譜；
[0034]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1提供的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響的柱狀圖；
[0035]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1提供的共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響的柱狀圖；
[0036]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1提供的不同Kan濃度對(duì)不定芽平均出芽數(shù)的影響圖；
[0037]圖7是本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化植株基因檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]本發(fā)明提供了一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，包括以下步驟:
[0039]I)將酸棗葉片接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)2?4d，得到外植體，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括0.8?3.0mg/L噻苯隆、0.2?0.5mg/L吲哚丁酸、28?32g//L蔗糖和5?7g/L瓊脂；
[0040]2)將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染所述步驟I)得到的外植體，得到被侵染的外植體；
[0041 ] 3)將所述步驟2)得到的被侵染的外植體置于WPM固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2?4d，所述WPM固體培養(yǎng)基包括0.5?2.0mg/L噻苯隆和0.25?0.4mg/L吲哚丁酸；
[0042]4)將所述步驟3)暗培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)入WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)14?16d，所述WPM固體篩選培養(yǎng)基含有0.8?2.5mg/L噻苯隆、0.2?0.4mg/L吲哚丁酸、180?220mg/L頭孢霉素和15?25mg/L卡那霉素；
[0043]所述暗培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入WPM伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行葉片再生的伸長培養(yǎng)，得到不定芽，所述WPM伸長培養(yǎng)基含有0.lmg/L吲哚乙酸和0.5mg/L赤霉素的；
[0044]5)將所述步驟4)得到的不定芽擴(kuò)繁，得到遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株。
[0045]本發(fā)明將酸棗葉片接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)2?4d，得到外植體。在本發(fā)明中，所述暗培養(yǎng)誘導(dǎo)的時(shí)間優(yōu)選為3d;所述暗培養(yǎng)誘導(dǎo)的溫度優(yōu)選為25±2°C，更優(yōu)選為25°C。在本發(fā)明中，所述步驟I)中的接種優(yōu)選以近軸端接觸培養(yǎng)基方式進(jìn)行;每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)酸棗刻傷葉片。
[0046]在本發(fā)明中，所述WPM基本培養(yǎng)基包括大量元素1、微量元素I和有機(jī)成分I:
[0047]具體的，在本發(fā)明中，所述大量元素I優(yōu)選含有380?420mg//L的NH4NO3,更優(yōu)選為390 ?410mg/L，最優(yōu)選為400mg/L ；
[0048]所述大量元素I優(yōu)選含有540?580mg/L的Ca(NO3)2.4H20，更優(yōu)選為550?570mg/L，最優(yōu)選為556mg/L ；
[0049]所述大量元素I優(yōu)選含有970?1010mg/L的K2S04，更優(yōu)選為980?1000mg/L，最優(yōu)選為990mg/L;
[0050]所述大量元素I優(yōu)選含有90?100mg/lJ^CaCl2.2H20，更優(yōu)選為93?98mg/L，最優(yōu)選為 96mg/L;
[0051 ] 所述大量元素I優(yōu)選含有150?200mg/L的KH2P04，更優(yōu)選為160?180mg/L，最優(yōu)選為170mg/L;
[0052]所述大量元素I優(yōu)選含有350?400mg/L的MgSO4.7H20，更優(yōu)選為360?380mg/L，最優(yōu)選為370mg/L;
[0053]所述微量元素I優(yōu)選含有:0.2?0.3mg/L的Na2MoO4.2H20，更優(yōu)選為0.22?0.28mg/L，最優(yōu)選為0.25mg/L ；
[0054]所述微量元素I優(yōu)選含有22?24mg/L的MnSO4.H20，更優(yōu)選為22.2?23.5mg/L，最優(yōu)選為22.4mg/L;
[0055]所述微量元素I優(yōu)選含有8?9mg/L的ZnSO4.7H20，更優(yōu)選為8.2?8.8mg/L，最優(yōu)選為8.6mg/L;
[0056]所述微量元素I優(yōu)選含有0.2?0.3mg/L的C11SO4.5出0，更優(yōu)選為0.22?0.281^/1，最優(yōu)選為0.25mg/L;
[0057]所述微量元素I優(yōu)選含有27?28mg/L的FeSO4.7出0，更優(yōu)選為27.3?27.91^/1，最優(yōu)選為27.8mg/L;
[0058]所述微量元素I優(yōu)選含有37?38.5mg/L的Na2EDTA.2出0，更優(yōu)選為37.2?38.3!^/L，最優(yōu)選為37.3mg/L ；
[0059]所述微量兀素I優(yōu)選含有6?7mg/L的H3BO3，更優(yōu)選為6.1?6.6mg/L，最優(yōu)選為6.2mg/L。
[0000] 所述有機(jī)成分I優(yōu)選含有:95?110mg/L的肌醇，更優(yōu)選為98?105mg/L，最優(yōu)選為100mg/L；
[0061 ] 所述有機(jī)成分I優(yōu)選含有0.8?1.4mg/L的維生素Bi，更優(yōu)選為0.9?1.3mg/L，最優(yōu)選為1.0mg/L;
[0062]所述有機(jī)成分I優(yōu)選含有0.3?0.7mg/L的煙酸，更優(yōu)選為0.35?0.60mg/L，最優(yōu)選為0.5mg/L;
[0063]所述有機(jī)成分I優(yōu)選含有0.35?0.6mg/L的維生素B6，更優(yōu)選為0.4?0.55mg/L，最優(yōu)選為0.5mg/L;
[0064]所述有機(jī)成分I優(yōu)選含有1.6?2.2mg/L的甘氨酸，更優(yōu)選為1.8?2.lmg/L，最優(yōu)選為2.0mg/Lο
[0065]在本發(fā)明中，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其它組分。
[0066]在本發(fā)明中，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括0.8?3.0mg/L噻苯隆，優(yōu)選為1.0mg/L?2.0mg/L；
[0067]所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括0.2?0.5mg/L吲哚丁酸，優(yōu)選為0.3mg/L?0.4mg/L；
[0068]所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括28?32g/L蔗糖，優(yōu)選為30g/L;
[0069]所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括5?7g/L瓊脂，優(yōu)選為6g/L。
[0070]在本發(fā)明中，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基的pH值為5?6.5，更優(yōu)選為5.8?6.0。
[0071]在本發(fā)明中，所述步驟I)前優(yōu)選還包括:將酸棗葉片進(jìn)行前處理，得到用于進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)的材料；
[0072]所述前處理的過程優(yōu)選具體為:剪下酸棗組培苗形態(tài)學(xué)自上而下第3?5枚葉片，將剪下的葉片作為轉(zhuǎn)化材料；
[0073]將所述轉(zhuǎn)化材料沿葉片中脈垂直方向橫切2?4個(gè)傷口，切斷主脈但不切斷葉片。
[0074]得到外植體后，本發(fā)明將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染所述外植體。在本發(fā)明中，所述植物表達(dá)載體優(yōu)選為pBii21-sros，具有pt-sros所示的核苷酸序列，所述表達(dá)載體優(yōu)選以亞精胺合成酶基因SPDS作為目的基因，基因登陸號(hào)為JQ002667.1，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ΝΡΤΠ作為篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中，所述侵染的時(shí)間為10?20min，更優(yōu)選為15min;所述侵染的溫度優(yōu)選為25±2°C，更優(yōu)選為25°C。
[0075]在本發(fā)明中，所述農(nóng)桿菌菌液的制備方法包括以下步驟:
[0076]將農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至OD6qq為0.5?0.7，所述YEB液體培養(yǎng)基包含40?55mg/L利福平、40?55mg/L頭孢霉素和40?55mg/L卡那霉素；
[0077]以0.02?0.05%的接種量將所述暗培養(yǎng)得到的菌液接種于不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6qq為0.4?1.0;
[0078]將所述OD6qq為0.4?1.0的菌液與摩爾濃度為150?300ymol/L的乙酰丁香酮混合，繼續(xù)培養(yǎng)0.8?1.5h，得到農(nóng)桿菌菌液。
[0079]本發(fā)明的農(nóng)桿菌菌株優(yōu)選為LBA4404根癌農(nóng)桿菌，購自北京華越洋生物。
[0080]本發(fā)明將農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng)，所述暗培養(yǎng)優(yōu)選在28°C的恒溫避光搖床上以180?200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD6qq為0.5?0.7。在本發(fā)明中，所述YEB液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括40?55mg/L的利福平，更優(yōu)選為45?50mg/L;
[0081 ] 所述YEB液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括40?55mg/L頭孢霉素，更優(yōu)選為45?50mg/L頭孢霉素；
[0082]所述YEB液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括40?55mg/L卡那霉素，更優(yōu)選為45?50mg/L卡那霉素。
[0083]在本發(fā)明中，所述農(nóng)桿菌菌株在YEB液體培養(yǎng)基中優(yōu)選暗培養(yǎng)至OD6qq為0.6?0.65ο
[0084]所述暗培養(yǎng)結(jié)束后，本發(fā)明將所述暗培養(yǎng)得到的農(nóng)桿菌菌株的菌液接種于不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6qq為0.4?1.0。在本發(fā)明中，所述接種的接種量優(yōu)選為0.02?0.05 %，更優(yōu)選為0.03%ο在本發(fā)明中，所述不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基與上述技術(shù)方案所述YEB液體培養(yǎng)基相比，除了不含有抗生素以外，其他組分相同。在本發(fā)明中，所述農(nóng)桿菌菌株的菌液在所述不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中優(yōu)選培養(yǎng)至OD6qq為0.6?
0.8。
[0085]在本發(fā)明中，所述OD值的檢測(cè)采用常規(guī)的吸光度檢測(cè)方法，本發(fā)明對(duì)所述吸光度檢測(cè)的設(shè)備沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分光光度計(jì)即可。
[0086]在所述不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)完成后，本發(fā)明將得到的菌液與摩爾濃度為150?300ymol/mL的乙酰丁香酮混合，繼續(xù)培養(yǎng)0.8?1.5h，得到農(nóng)桿菌菌液。在本發(fā)明中，所述乙酰丁香酮的摩爾濃度優(yōu)選為180?250ymol/L，更優(yōu)選為200ymol/L。在本發(fā)明中，不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)得到的菌液與乙酰丁香酮的體積比優(yōu)選為400?600:1，更優(yōu)選為500?I，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為I?1.2h;所述繼續(xù)培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為27?29 °C，更優(yōu)選為28 °C。
[0087]得到被侵染的外植體后，本發(fā)明將所述被侵染的外植體接種于WPM固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2?4d。在本發(fā)明中，所述WPM固體培養(yǎng)基優(yōu)選包括0.5?2.0mg/L的噻苯隆，更優(yōu)選為
1.0?1.5mg/L；
[0088]所述WPM固體培養(yǎng)基優(yōu)選包括0.25?0.4mg/L卩引噪丁酸，更優(yōu)選為0.3?0.35mg/L。
[0089]在本發(fā)明中，所述WPM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25±2°C，更優(yōu)選為25 °C；所述WPM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選3d。
[0090]完成在所述WPM固體培養(yǎng)基上的暗培養(yǎng)后，本發(fā)明將得到的葉片轉(zhuǎn)入WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)14?16d ο在本發(fā)明中，所述WPM固體篩選培養(yǎng)基包括0.8?2.5mg/L的噻苯隆，優(yōu)選為I.0?2.0mg/L;
[0091 ] 所述WPM固體篩選培養(yǎng)基包括0.2?0.4mg/L的吲哚丁酸，優(yōu)選為0.3mg/L;
[0092 ] 所述WPM固體篩選培養(yǎng)基包括180?220mg/L頭孢霉素，優(yōu)選為190?21 Omg/L，更優(yōu)選為200mg/L頭孢霉素；
[0093]所述WPM固體篩選培養(yǎng)基包括15?25mg/L卡那霉素，優(yōu)選為18?22mg/L，更優(yōu)選為20mg/Lo
[0094]在本發(fā)明中，所述WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25±2°C，更優(yōu)選為25 °C ;所述WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為14?16d，更優(yōu)選為15d。
[0095]所述暗培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入WPM伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行葉片再生的伸長培養(yǎng)，得到不定芽，所述WPM伸長培養(yǎng)基含有0.lmg/L吲哚乙酸和0.5mg/L赤霉素的；
[0096]在本發(fā)明中，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的光周期優(yōu)選為12?16h/d，更優(yōu)選為14h/d;所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為30?40d;
[0097]在本發(fā)明中，所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括0.08?0.12mg/L吲哚丁酸，優(yōu)選為0.09?0.1111^凡，更優(yōu)選為0.1011^凡；
[0098]所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括0.3?0.6mg/L赤霉素，優(yōu)選為0.35?0.55mg/L，更優(yōu)選為0.50mg/L;
[0099]所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括180?220mg/L頭孢霉素，優(yōu)選為190?210mg/L，更優(yōu)選為200mg/L;
[0100]所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括15?25mg/L卡那霉素，優(yōu)選為16?22mg/L，更優(yōu)選為20mg/L。
[0101]得到不定芽后，本發(fā)明將所述不定芽擴(kuò)繁，得到遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株。
[0102]本發(fā)明將經(jīng)過不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的不定芽優(yōu)選在莖長為15?20_時(shí)，將不定芽轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。
[0103]在本發(fā)明中，所述MS基本培養(yǎng)基優(yōu)選包括大量元素Π、微量元素Π和有機(jī)成分Π;
[0104]具體的，所述大量元素Π優(yōu)選含有:1600?1700mg/L的順4勵(lì)3，更優(yōu)選為1650mg/L;
[0105]所述大量元素Π優(yōu)選含有:1850?1920mg/L的KNO3,更優(yōu)選為1880?1910mg/L，最優(yōu)選為1900mg/L;
[0106]所述大量元素Π優(yōu)選含有:420?450mg/L的CaCl2.2H20，更優(yōu)選為430?445mg/L，最優(yōu)選為440mg/L;
[0107]所述大量元素Π優(yōu)選含有:350?380mg/L的MgSO4.7H20，更優(yōu)選為360?375mg/L，最優(yōu)選為370mg/L;
[0108]所述大量元素Π優(yōu)選含有:1650?1730mg/L的KH2P04，更優(yōu)選為1680?1720mg/L，最優(yōu)選為1700mg/L;
[0109]所述微量元素Π優(yōu)選含有0.75?0.85mg/L的KI，更優(yōu)選為0.78?0.84mg/L，最優(yōu)選為 0.83mg/L;
[0110]所述微量元素11優(yōu)選含有0.22?0.3011^/1的恥2]\1004.2H20，更優(yōu)選為0.24?0.28mg/L，最優(yōu)選為0.25mg/L ；
[0111]所述微量元素Π優(yōu)選含有22.0?23.0mg/L的MnSO4.4H20，更優(yōu)選為22.1?22.7mg/L，最優(yōu)選為 22.3mg/L ；
[0112]所述微量元素Π優(yōu)選含有8.4?8.8mg/L的ZnSO4.7H20，更優(yōu)選為8.5?8.7mg/L，最優(yōu)選為8.6mg/ ；
[0113]所述微量元素Π優(yōu)選含有0.02?(K03mg/U^CuS04.5H20，更優(yōu)選為0.022?0.028mg/L，最優(yōu)選為0.025mg/L ；
[0114]所述微量元素Π優(yōu)選含有0.02?0.03mg/L的CoCl2.6H20，更優(yōu)選為0.023?
0.029mg/L，最優(yōu)選為0.025mg/L；
[0115]所述微量元素Π優(yōu)選含有27?28mg/L的FeSO4.7出0，更優(yōu)選為2.73?27.91^/1，最優(yōu)選為27.8mg/L;
[0116]所述微量元素Π優(yōu)選含有36.8?38mg/L的Na2EDTA.2H20，更優(yōu)選為37.1?37.8mg/L，最優(yōu)選為37.3mg/L ；
[0117]所述微量元素Π優(yōu)選含有6.0?7.2mg//L的H3BO3，更優(yōu)選為6.1?6.9mg/L，最優(yōu)選為6.2mg/L;
[ΟΙ18] 所述有機(jī)成分Π優(yōu)選含有85?11 Omg/L的肌醇，更優(yōu)選為88?105mg/L，最優(yōu)選為100mg/L；
[0119]所述有機(jī)成分Π優(yōu)選含有0.3?0.6mg/L的維生素仏，更優(yōu)選為0.35?0.55mg/L，最優(yōu)選為0.5mg/L;
[0120]所述有機(jī)成分Π優(yōu)選含有0.3?0.6mg/L的煙酸，更優(yōu)選為0.40?0.55mg/L，最優(yōu)選為 0.5mg/L;
[0121 ] 所述有機(jī)成分Π優(yōu)選含有0.3?0.6mg/L的維生素B6，更優(yōu)選為0.42?0.58mg/L，最優(yōu)選為0.5mg/L;
[0? 22]所述有機(jī)成分Π優(yōu)選含有I.8?2.5mg/L的甘氨酸，更優(yōu)選為I.9?2.4mg/L，最優(yōu)選為2.0mg/L。
[0123]在本發(fā)明中，所述MS培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其它組分。
[0124]在本發(fā)明中，所述MS培養(yǎng)基包括0.8?1.2mg/L 6_芐氨基腺嘌呤，優(yōu)選為0.9?
1.lmg/L，更優(yōu)選為 1.0mg/L ；
[0125]所述MS培養(yǎng)基包括0.3?0.6mg/L吲哚丁酸，優(yōu)選為0.35?0.5mg/L，更優(yōu)選為0.4mg/L；
[0126]所述MS培養(yǎng)基包括18?22mg/L卡那霉素，優(yōu)選為19?21mg/L，更優(yōu)選為20mg/L。
[0127]在本發(fā)明中，所述MS培養(yǎng)基的pH值為5?6.5，更優(yōu)選為5.8?6.0。
[0128]本發(fā)明中，所述擴(kuò)繁后優(yōu)選還包括:將所述擴(kuò)繁后得到的遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株進(jìn)行分子檢測(cè)。
[0129]本發(fā)明中，所述分子檢測(cè)優(yōu)選包括以下步驟:
[0130]利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)是否有目的基因Pt-SPDS(1094bp)條帶，確定目的基因DNA的整合情況。若出現(xiàn)目的基因條帶，可初步說明SPDS基因已轉(zhuǎn)入酸棗植株。
[0131]在本發(fā)明中，所述分子檢測(cè)后優(yōu)選還包含:將所述檢測(cè)后得到的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行小苗生根和移栽。
[0132]在本發(fā)明中，所述小苗生根和移栽的過程優(yōu)選具體為:將所述轉(zhuǎn)基因植株在不含抗生素的酸棗繼代培養(yǎng)基中繼代3次，待株高長至1.5?2cm后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌生根培養(yǎng)，待組培苗根系生長健壯或暴露于Jiffy育種塊外，將組培瓶蓋打開，使其逐步適應(yīng)外部環(huán)境條件，期間及時(shí)添加水或液體生根培養(yǎng)基以保持水分。煉苗3d后，取出植株，移栽至含有蛭石與土為1:1的基質(zhì)中，放入人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C、濕度90%、光照強(qiáng)度20001x、光周期14h光/1h暗。4周后，轉(zhuǎn)至溫室繼續(xù)生長。
[0133]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其它組分。
[0134]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基包括0.8?1.2mg/L 6_芐氨基腺嘌呤，優(yōu)選為0.9?1.lmg/L，更優(yōu)選為1.0mg/L;
[0135]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基包括0.3?0.6mg/L吲哚丁酸，優(yōu)選為0.35?
0.5mg/L，更優(yōu)選為0.4mg/L ；
[0136]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基包括25?35g/L的蔗糖，優(yōu)選為28?32g/L，更優(yōu)選為30g/L;
[0137]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基包括5?7g/L的瓊脂，優(yōu)選為5.2?6.5g/L，更優(yōu)選為 5.8g/L;
[0138]在本發(fā)明中，所述酸棗繼代培養(yǎng)基的pH值為5.0?6.5，更優(yōu)選為5.8?6.0。
[0139]在本發(fā)明中，所述生根培養(yǎng)基優(yōu)選為包括0.35?0.5mg/L吲哚丁酸的1/2MS液體培養(yǎng)基以及直徑為30mm的Jif fy營養(yǎng)塊;所述液體生根培養(yǎng)基優(yōu)選為包括0.35?0.5mg/L吲哚丁酸的1/2MS液體培養(yǎng)基。
[0140]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明提供的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是不能將它們理解為對(duì)本申請(qǐng)保護(hù)范圍的限定。
[0141]實(shí)施例1
[0142]選取長勢(shì)良好的酸棗組培苗，剪下形態(tài)學(xué)自上而下第3?5枚葉片作為轉(zhuǎn)化材料，沿葉片中脈垂直方向橫切2個(gè)傷口，切斷主脈但不切斷葉片，以近軸端接觸培養(yǎng)基方式(如圖1，a)接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基(TDZ1.0mg/L+IBA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂)。在WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)誘導(dǎo)3d后，進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。
[0143]WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基的pH值為5.8 ^PM基本培養(yǎng)基配方為:
[0144](I)大量元素:NH4N03(400mg/L)、Ca(N03)2.4H20(556mg/L)K2S04(990mg/L)、CaCl2.2H20(96mg/L)、KH2P04(170mg/L)、MgS04.7H20(370mg/L)；
[0145](2)微量元素:Na2MoO4.2H20(0.25mg/L)、MnS〇4.H20(22.4mg/L)、ZnS〇4.7H20(8.6mg/L)、CuS04.5H20(0.25mg/L)、FeS〇4.7H20(27.8mg/L)、Na2EDTA.2H20(37.3mg/L)、H3B〇3(6.2mg/L) ； (3)有機(jī)成分:肌醇100mg/L、維生素Bil.0mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素ΒθΟ.5mg/L、甘氨酸 2.0mg/L。
[Ο146]將農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于20ml含50mg/L利福平、50mg/L頭孢霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C黑暗下180rpm振蕩培養(yǎng)至OD6qq為0.6;取20uL上述菌液于50mL不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD6qq接近0.4?0.8，不同農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響結(jié)果如圖2所示，當(dāng)菌液0D_值為0.8時(shí)顯著低于0.4和0.6時(shí)的轉(zhuǎn)化率，說明合適的菌液濃度范圍為0.4?0.6。隨后在超凈臺(tái)中向該菌液加入200ymol/L乙酰丁香酮，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)lh。
[0147]農(nóng)桿菌菌株含有pBI121載體，表達(dá)載體圖譜如圖3所示。載體以亞精胺合成酶基因SPDS作為目的基因，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPT Π作為篩選標(biāo)記基因。
[0148]外植體侵染
[0149]①外植體的收集:在超凈工作臺(tái)里用鑷子將培養(yǎng)皿中的外植體加入高溫滅菌的空三角瓶中；
[0150]②外植體的侵染:將制備好的農(nóng)桿菌菌液倒入上述三角瓶中，用手輕輕搖動(dòng)，使所有葉片均浸入農(nóng)桿菌菌液中，侵染10，15，20min，農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響結(jié)果如圖4所示，侵染20min的平均轉(zhuǎn)化率極明顯低于1min和15min，說明侵染時(shí)間為I Omin或15min時(shí)可得到更多的轉(zhuǎn)化苗。
[0151]③多余菌液的去除:侵染結(jié)束，將外植體用鑷子加入含無菌濾紙的培養(yǎng)皿中；用無菌濾紙吸干外植體表面剩余菌液。
[0152]共培養(yǎng)
[0153]將感染后的外植體放在添加有l(wèi).0mg/LTDZ和0.3mg/LIBA的WPM培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基上25°C條件下共培養(yǎng)分別2d，3d，4d，共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酸棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化率影響結(jié)果如圖5所示，共培養(yǎng)3d時(shí)平均轉(zhuǎn)化率最高，即共培養(yǎng)的最佳時(shí)間為3d。
[0154]不定芽的誘導(dǎo)
[0155]①葉片再生不定芽的誘導(dǎo):共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片用無菌水清洗3次，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中；篩選培養(yǎng)基為WPM固體培養(yǎng)基并添加1.0mg/LTDZ、0.3mg/L IBA、200mg/LCef?和20mg/L Kan，不同Kan濃度對(duì)不定芽平均出芽數(shù)的影響結(jié)果如圖6所示，當(dāng)Kan濃度為20mg/L時(shí)，葉片分化率迅速降低，且平均每個(gè)葉片出芽個(gè)數(shù)開始小于I。而繼續(xù)增加卡那霉素的濃度至25mg/L時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉片分化率極低，幾乎沒有長勢(shì)良好的不定芽。選擇20mg/L的卡那霉素作為篩選轉(zhuǎn)化植株的臨界濃度。25°C條件下暗培養(yǎng)，直至葉片暗培養(yǎng)共21d。
[0156]②不定芽的萌發(fā)和生長(如圖l，b):暗培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM固體培養(yǎng)基附加0.lmg/L IBA、0.5mg/L GA3、200mg/LCef?和20mg/L Kan;培養(yǎng)溫度為25°C、光周期為14h。
[0157]不定芽的轉(zhuǎn)接
[0158]待不定芽的莖長為15?20mm將其轉(zhuǎn)到含1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤和0.4mg/L吲哚丁酸以及20mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁(如圖l，c)。
[0159]MS基本培養(yǎng)基pH值為5.8，MS基本培養(yǎng)基配方為:
[0160](I)大量元素:NH4N03(1650mg/L)、KN03(1900mg/L)、CaCl2.2H20(440mg/L)、MgSO4.7H20(370mg/L)、KH2P04(1700mg/L);
[0161](2)微量元素:1(1(0.8311^/1)、恥2]?004.2H20(0.25mg/L)、MnS〇4.4H20(22.3mg/L)、ZnSO4.7H20(8.6mg/L)、CuS04.5H20(0.025mg/L)、CoCl2.6H20(0.025mg/L) ^FeSO4.7H20(27.8mg/L)、Na2EDTA.2H20(37.3mg/L) ^H3BO3(6.2mg/L)；
[ΟΙ62] (3)有機(jī)成分:肌醇100mg/L、維生素Bl0.5mg/L、煙酸0.5mg/L、維生素Β6θ.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
[0163]轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)
[0164]轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)是指利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)是否有目的基因條帶，確定目的基因DNA的整合情況。
[0165]本發(fā)明第一次篩選后共得到102個(gè)卡那霉素抗性芽。第三次篩選后有19個(gè)抗性芽長成完整植株，提取這些植株的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，共有9株呈陽性，占抗性植株的47%，陽性植株轉(zhuǎn)化率為8.82%o
[0166]小苗生根和移栽
[0167]檢測(cè)結(jié)束的植株繼續(xù)培養(yǎng)，待長至株高為1.5?2cm后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，根生長至2?3cm后，移入營養(yǎng)土中繼續(xù)生長。所述小苗生根培養(yǎng)基是將含有吲哚丁酸的1/2MS液體培養(yǎng)基澆在Jiffy營養(yǎng)塊后，在高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌得到的，最終得到的培養(yǎng)基中含有0.4mg/L的吲哚丁酸。
[0168]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，包括以下步驟: 1)將酸棗葉片接種于WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)2?4d，得到外植體，所述WPM不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)基包括0.8?3.0mg/L噻苯隆、0.2?0.5mg//L吲哚丁酸、28?32g//L蔗糖和5?7g/L瓊脂； 2)將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染所述步驟I)得到的外植體，得到被侵染的外植體； 3)將所述步驟2)得到的被侵染的外植體置于WPM固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2?4d，所述WPM固體培養(yǎng)基包括0.5?2.0mg/L噻苯隆和0.25?0.4mg/L吲哚丁酸； 4)將所述步驟3)暗培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)入WPM固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)14?16d，所述WPM固體篩選培養(yǎng)基含有0.8?2.5mg/L噻苯隆、0.2?0.4mg/L吲哚丁酸、180?220mg/L頭孢霉素和15?25mg/L卡那霉素； 所述暗培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)入WPM伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行葉片再生的伸長培養(yǎng)，得到不定芽，所述WPM伸長培養(yǎng)基含有0.lmg/L吲哚乙酸和0.5mg/L赤霉素的； 5)將所述步驟4)得到的不定芽擴(kuò)繁，得到遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟2)中侵染的時(shí)間為1?20min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟2)中植物表達(dá)載體為pB 1121-SPDS。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟4)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的光周期為12?16h/d，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為30?40d，所述WPM固體不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括0.08?0.12mg/L吲哚丁酸、0.3?0.6mg/L赤霉素、180?220mg/L頭孢霉素和15?25mg/L卡那霉素。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟5)的不定芽擴(kuò)繁具體為:待不定芽的莖長為15?20mm時(shí)，將不定芽轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，所述MS培養(yǎng)基包括0.8?1.2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.3?0.6mg/L吲哚丁酸和18?22mg/L卡那霉素。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟I)、3)、4)和5)中的培養(yǎng)溫度獨(dú)立地選為25 ± 2 °C。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟I)前還包括:將酸棗葉片進(jìn)行前處理； 所述前處理的過程具體為:剪下酸棗組培苗形態(tài)學(xué)自上而下第3?5枚葉片，將剪下的葉片作為轉(zhuǎn)化材料； 將所述轉(zhuǎn)化材料沿葉片中脈垂直方向橫切2?4個(gè)傷口，切斷主脈但不切斷葉片； 所述步驟I)中的接種以近軸端接觸培養(yǎng)基方式進(jìn)行。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌菌液的制備方法包括以下步驟: 將農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至0D_為0.5?0.7，所述YEB液體培養(yǎng)基包含40?55mg/L利福平、40?55mg/L頭孢霉素和40?55mg/L卡那霉素； 以0.02?0.05 %的接種量將所述暗培養(yǎng)得到的菌液接種于不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6qq為0.4?1.0; 將所述0D6QQ為0.4?1.0的菌液與150?300ymol/L的乙酰丁香酮混合，繼續(xù)培養(yǎng)0.8?1.5h，得到農(nóng)桿菌菌液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述步驟5)后還包括:將所述遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株進(jìn)行分子檢測(cè)； 所述分子檢測(cè)包括以下步驟: 利用PCR方法對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化后的酸棗植株進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)是否有目的基因條帶，確定目的基因DNA的整合情況。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利用葉片為受體建立酸棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，所述分子檢測(cè)后還包含:將所述檢測(cè)后的植株進(jìn)行小苗生根和移栽； 所述小苗生根和移栽的過程具體為:將所述檢測(cè)后的植株繼續(xù)培養(yǎng)，待長至株高為1.5?2cm后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根;根生長至2?3cm后，移入營養(yǎng)土中繼續(xù)生長。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105838734SQ201610377504
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】李穎岳, 王歡, 龐曉明, 黃飛逸, 崔艷紅, 侯璐
【申請(qǐng)人】北京林業(yè)大學(xué)