用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人cyp2c19基因分型參比品及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是一種用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法，參比品為人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重組質(zhì)粒，人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重組質(zhì)粒包括野生型和突變型。本發(fā)明極大地方便了結(jié)果的判定，保證了判定的準(zhǔn)確性，可將以上參比質(zhì)粒制備成試劑盒，將為基因分型提供便利，有助于同型輸注的開(kāi)展，并為評(píng)估基因分型方法的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度提供重要的參考依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法
[0001 ] 技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種人類(lèi)幽門(mén)螺旋桿菌抗原基因分型參比品及其制備方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
全球半數(shù)以上人口感染幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori ,H.pylori),中國(guó)是一個(gè)
H.pylori感染率較高的國(guó)家，達(dá)56.22 %，某些地區(qū)高達(dá)77.22 %。幾乎所有感染幽門(mén)螺桿菌的人均患有慢性胃炎，只有少數(shù)會(huì)發(fā)展成為消化性潰瘍，而其中有約I % - 2 %發(fā)展成為胃癌。幽門(mén)螺桿菌感染與臨床消化道疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如慢性胃炎，消化性潰瘍，十二指腸潰瘍，胃癌和淋巴細(xì)胞增生等。1994年WHO將HP列為I類(lèi)致癌因子。研究表明，幽門(mén)螺桿菌感染為胃癌發(fā)生的病因，對(duì)幽門(mén)螺桿菌的根除可明顯降低人群胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，HP感染的根除治療一直是HP研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，具有重要的臨床意義。
[0003]HP耐藥是全球性問(wèn)題，是HP根治率下降的主要原因。以質(zhì)子栗抑制劑(PPI)結(jié)合阿莫西林和克拉霉素(或甲硝唑)的三聯(lián)療法，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一線(xiàn)抗HP感染治療組合。喹諾酮類(lèi)藥物是HP根治的二線(xiàn)藥物。抗HP治療的療效主要受到以下兩個(gè)因素影響:一是抗生素耐藥，由于近年來(lái)抗生素的濫用，克拉霉素、甲硝唑、喹諾酮耐藥不斷上升，使得三聯(lián)療法或喹諾酮的有效率下降；另外一個(gè)重要因素是PPI的使用。PPI代謝與人細(xì)胞色素P450(CYP450)同工酶CYP2C 19密切相關(guān)，CYP2C19的基因多態(tài)性(強(qiáng)代謝、中代謝和弱代謝)決定了PPI在人體內(nèi)的代謝速度。因此，在使用三聯(lián)療法之前，提供準(zhǔn)確的抗生素耐藥信息和CYP2C19的類(lèi)型，針對(duì)性地選擇藥物進(jìn)行個(gè)體化用藥，能夠提高幽門(mén)螺桿菌根除率，同時(shí)減少抗生素濫用帶來(lái)的不良反應(yīng)和資源浪費(fèi)。
[0004]因此，為促進(jìn)對(duì)幽門(mén)螺桿菌個(gè)體化治療的研究，提供一種用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，用于評(píng)估人類(lèi)幽門(mén)螺旋桿菌抗原基因分型方法的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度，具有十分重要的意義。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人C Y P 2 C19基因分型參比品，參比品為人C Y P 2 C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒包括野生型和突變型。
[0007]作為優(yōu)選，人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重組質(zhì)粒中CYP2C19*2的第5個(gè)外顯子第681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基是G。
[0008]作為優(yōu)選，野生型的制備方法為:
A、擴(kuò)增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對(duì)CYP2C19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到中間產(chǎn)物； B、混合步驟:所述中間產(chǎn)物通過(guò)T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后培養(yǎng)12-14小時(shí)挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質(zhì)粒。
[0009]作為優(yōu)選，擴(kuò)增步驟中，擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物:正向引物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物為T(mén)CAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；擴(kuò)增條件為:94°C，預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30個(gè)循環(huán)；72°(:延伸21^11。
[0010]作為優(yōu)選，混合步驟中搖菌轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0011]作為優(yōu)選，突變型的制備方法為:
在特定位點(diǎn)采用定點(diǎn)突變方法弓I入突變堿基，首先以引進(jìn)的突變堿基在引物序列中為目標(biāo)，結(jié)合突變位點(diǎn)的具體情況設(shè)計(jì)上下游突變引物FM、RM;
第一輪PCR反應(yīng)，用突變引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側(cè)引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的DNA片段；
反應(yīng)體系:
模板DNA 10ng
10 X擴(kuò)增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二輪PCR反應(yīng)，用突變引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側(cè)弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質(zhì)粒為模板擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游的DNA片段。
[0012]反應(yīng)體系:
模板DNA 10ng
10 X擴(kuò)增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三輪PCR反應(yīng)，PCRl和PCR2產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合。取上述混合物為模板，用引物F和R擴(kuò)增全長(zhǎng)片段。
[0013]反應(yīng)體系:
PCRl擴(kuò)增產(chǎn)物50ng PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物50ng 10 X擴(kuò)增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5umol/L 引物R(30pmols)6.0ulTaq DNA聚合酶I?2 U加水至10ul反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
純化后的定點(diǎn)突變的目標(biāo)片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的突變型重組質(zhì)粒。
[0014]作為優(yōu)選，突變堿基和特定點(diǎn)位具體為CYP2C19*2的第5個(gè)外顯子第681位堿基G突變?yōu)锳，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基G突變?yōu)锳。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)，包括PCR擴(kuò)增，載體連接，轉(zhuǎn)化克隆，以及定點(diǎn)突變技術(shù)建立了人類(lèi)幽門(mén)螺旋桿菌抗原基因分型參比質(zhì)粒，該參比質(zhì)粒含有正確的基因序列，并在不同的基因分型方法中起到了預(yù)期的效果，并且也可以作為陽(yáng)性對(duì)照，極大地方便了結(jié)果的判定，保證了判定的準(zhǔn)確性，可將以上參比質(zhì)粒制備成試劑盒，將為基因分型提供便利，有助于同型輸注的開(kāi)展，并為評(píng)估基因分型方法的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度提供重要的參考依據(jù)。
[0016]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1:用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，參比品為人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒包括野生型和突變型。
[0017]人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒中 CYP2C19*2 的第 5 個(gè)外顯子第 681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基是G。
[0018]野生型的制備方法為:
A、擴(kuò)增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對(duì)CYP2C19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到中間產(chǎn)物；
B、混合步驟:所述中間產(chǎn)物通過(guò)T4DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后培養(yǎng)12-14小時(shí)挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質(zhì)粒。
[0019]擴(kuò)增步驟中，擴(kuò)增弓I物鈕証向弓I物和反向弓I物:正向弓I物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG ；反向引物為T(mén)CAGACAGGAATGAAGCACAGCTG ；擴(kuò)增條件為:94°C，預(yù)變性5min ； 94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸2min。
[0020]混合步驟中搖菌轉(zhuǎn)速為200 rpm。
[0021]突變型的制備方法為:
在特定位點(diǎn)采用定點(diǎn)突變方法弓I入突變堿基，首先以引進(jìn)的突變堿基在引物序列中為目標(biāo)，結(jié)合突變位點(diǎn)的具體情況設(shè)計(jì)上下游突變引物FM、RM;
第一輪PCR反應(yīng)，用突變引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側(cè)引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的DNA片段；
反應(yīng)體系:
模板DNA 10ng
10 X擴(kuò)增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二輪PCR反應(yīng)，用突變引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側(cè)弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質(zhì)粒為模板擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游的DNA片段。
[0022]反應(yīng)體系:
模板DNA 10ng
10 X擴(kuò)增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第三輪PCR反應(yīng)，PCRl和PCR2產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合。取上述混合物為模板，用引物F和R擴(kuò)增全長(zhǎng)片段。
[0023]反應(yīng)體系:
PCRl擴(kuò)增產(chǎn)物50ng PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物50ng 10 X擴(kuò)增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應(yīng)條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán)94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
純化后的定點(diǎn)突變的目標(biāo)片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的突變型重組質(zhì)粒。
[0024]突變堿基和特定點(diǎn)位具體為CYP2C19*2的第5個(gè)外顯子第681位堿基G突變?yōu)锳，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基G突變?yōu)锳。
[0025]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述參比品為人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質(zhì)粒包括野生型和突變型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重組質(zhì)粒中CYP2C19*2的第5個(gè)外顯子第681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基是G。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述野生型的制備方法為: A、擴(kuò)增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對(duì)CYP2C19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到中間產(chǎn)物； B、混合步驟:所述中間產(chǎn)物通過(guò)T4DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后培養(yǎng)12-14小時(shí)挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質(zhì)粒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述擴(kuò)增步驟中，擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物:正向引物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物為T(mén)CAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；擴(kuò)增條件為:94°C，預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30個(gè)循環(huán)；72°(:延伸21^11。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述混合步驟中搖菌轉(zhuǎn)速為200 rpm。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述突變型的制備方法為: 在特定位點(diǎn)采用定點(diǎn)突變方法引入突變堿基，首先以引進(jìn)的突變堿基在引物序列中為目標(biāo)，結(jié)合突變位點(diǎn)的具體情況設(shè)計(jì)上下游突變引物FM、RM; 第一輪PCR反應(yīng)，用突變引物RM(CYP2C19 *2-RM:GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT; CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側(cè)引物F (ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的DNA片段； 反應(yīng)體系: 模板DNA 10ng 10 X擴(kuò)增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應(yīng)條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán) 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第二輪PCR反應(yīng)，用突變引物FM(CYP2C19 *2-FM:ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC ；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側(cè)弓丨物R( TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質(zhì)粒為模板擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游的DNA片段， 反應(yīng)體系: 模板DNA 10ng 10 X擴(kuò)增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應(yīng)條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán) 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三輪PCR反應(yīng)，PCRl和PCR2產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合，取上述混合物為模板，用引物F和R擴(kuò)增全長(zhǎng)片段， 反應(yīng)體系: PCRl擴(kuò)增產(chǎn)物50ng PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物50ng 10 X擴(kuò)增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應(yīng)條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個(gè)循環(huán) 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min 純化后的定點(diǎn)突變的目標(biāo)片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)后挑選單克隆，再搖菌15小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，保存測(cè)序正確的突變型重組質(zhì)粒。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于幽門(mén)螺旋桿菌個(gè)體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:突變堿基和特定點(diǎn)位具體為CYP2C19*2的第5個(gè)外顯子第681位堿基G突變?yōu)锳，CYP2C19*3的第4個(gè)外顯子第636位堿基G突變?yōu)锳。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861684SQ201610295403
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】鐘婧, 黃惠蓮, 戴利成
【申請(qǐng)人】湖州市中心醫(yī)院