水稻OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因在調(diào)控花粉育性中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因在調(diào)控水稻花粉育性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的OsMTOPVIB蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。編碼所述OsMTOPVIB蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種培育雄性不育植物的方法，為抑制目的植物中所述基因的表達(dá)，得到雄性不育植物。本發(fā)明可以用于水稻雜交種子生產(chǎn)和育性控制，在水稻育種上具有重要意義，可以為增加水稻產(chǎn)量、提高水稻品質(zhì)提供重要的生物資源。
【專利說明】
水稻OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因在調(diào)控花粉育性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種水稻OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因在調(diào)控花粉育性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是人類最重要的糧食作物之一，占全球谷類作物種植面積的1/3,為人類提供 40%的熱能。水稻是世界一半人口的食物來源。東亞和東南亞的絕大部分人口均以稻米為 食。水稻是中國第一大糧食作物，同時，中國也是世界上最大的稻米生產(chǎn)國。因此，水稻的穩(wěn) 產(chǎn)和增產(chǎn)將直接關(guān)系到中國乃至世界的糧食安全。探索提高水稻產(chǎn)量的手段成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 上面臨的關(guān)鍵問題。在耕地面積逐步減少的趨勢下，單純靠提高水稻種植面積來滿足對水 稻產(chǎn)量的需求已經(jīng)基本上成為不可能。解決糧食安全問題，需要實(shí)現(xiàn)水稻育種上的新突破。 我國的水稻育種技術(shù)經(jīng)歷了三次革命。第一次綠色革命發(fā)生在二十世紀(jì)50年代末到60年代 初，半矮品種的推廣，使得水稻平均產(chǎn)量從不足1500kg/hm 2達(dá)到近4500kg/hm2。第二次綠色 革命發(fā)生二十世紀(jì)70年代，袁隆平培育出的三系雜交水稻，使得水稻單產(chǎn)量在矮化育種基 礎(chǔ)上再次提升了近20%，水稻平均產(chǎn)量升至6000kg/hm 2。緩解了我國人口迅速增長與糧食 短缺的矛盾。水稻育種的第三次飛躍實(shí)現(xiàn)于"超級稻育成"，水稻產(chǎn)量達(dá)到12000kg/hm 2。縱 觀水稻育種歷史，水稻單產(chǎn)的飛躍實(shí)現(xiàn)于雜種優(yōu)勢的廣泛應(yīng)用。雜種優(yōu)勢是生物界的一種 普遍現(xiàn)象，其指兩個遺傳性不同的親本雜交，雜種一代比雙親具有更強(qiáng)的生活力、生長勢、 抗性、適應(yīng)性和豐產(chǎn)性。雜交水稻較普通水稻表現(xiàn)了營養(yǎng)、生殖、抗性和品質(zhì)等眾多優(yōu)勢。其 推廣應(yīng)用為中國乃至世界的糧食生產(chǎn)作出了巨大貢獻(xiàn)。三系雜交水稻中的三系是指：（1)雄 性不育系。該不育系植株的雌蕊發(fā)育正常，但雄蕊的發(fā)育退化，表現(xiàn)無花粉或者花粉敗育， 不能自交結(jié)實(shí)。（2)保持系。該系水稻植株的雌雄蕊均發(fā)育正常，將其花粉授給雄性不育系， 仍可獲得雄性不育的植株。（3)恢復(fù)系。將其花粉授給雄性不育系植株，產(chǎn)生雜交種，雜交種 后代雄蕊正常，可恢復(fù)育性，可進(jìn)行自交結(jié)實(shí)，有目的的選取具有增產(chǎn)優(yōu)勢的雜交種用于大 田生產(chǎn)。水稻雄性不育系是雜交水稻制種的關(guān)鍵。水稻雄性不育資源的獲得是實(shí)現(xiàn)強(qiáng)優(yōu)組 合選育的重要基礎(chǔ)。利用雄性不育系能大幅度提高雜種種子的產(chǎn)量和質(zhì)量。然而，自然突變 導(dǎo)致的雄性不育株少兒又少。極其罕見。加之對雄性不育株鑒定費(fèi)工費(fèi)時。因此，利用基因 工程方法獲得雄性不育系成為育種家的選擇。
[0003] 生物的生活周期包括二倍體孢子體世代到單倍體配子體世代的交替轉(zhuǎn)換。有性生 殖是自然界中普遍存在的生殖類型。有性生殖是指通過雌雄配子體融合形成受精卵，由受 精卵發(fā)育為完整植株的生殖方式。減數(shù)分裂在雌雄配子體發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用，是有 性生殖生物的關(guān)鍵細(xì)胞學(xué)事件。減數(shù)分裂在真核生物生活史中具有極其重要的意義:一方 面，減數(shù)分裂產(chǎn)生染色體數(shù)目減半配子，通過受精形成合子，發(fā)育為新個體，維持親代與子 代體細(xì)胞染色體數(shù)目的恒定，保證物種的相對穩(wěn)定性；另一方面，減數(shù)分裂過程中，同源染 色體非姊妹染色單體間交叉互換以及非同源染色體的自由組合，促使配子的遺傳物質(zhì)在雙 親的染色體間進(jìn)行交融和組合，促使配子的遺傳多樣化，增加了后代對環(huán)境的適應(yīng)性，同時 也增強(qiáng)了群體的遺傳多樣性，為自然選擇提供了良好的原材料。
[0004] 減數(shù)分裂和糧食生產(chǎn)的關(guān)系非常密切，農(nóng)作物的收獲產(chǎn)品大部分是減數(shù)分裂的直 接產(chǎn)物(包括果實(shí)和種子）。農(nóng)作物品種的選育過程是遺傳物質(zhì)重組、優(yōu)化和選擇的過程?，F(xiàn) 在農(nóng)作物品種的改良主要依賴有性雜交技術(shù)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了雜交親本的遺傳物質(zhì)的廣泛交 換和重組，給農(nóng)作物新品種的遺傳改良和選育帶來生機(jī)。優(yōu)良性狀組合的實(shí)現(xiàn)依賴于減數(shù) 分裂的同源染色體重組事件。對水稻進(jìn)行減數(shù)分裂重組相關(guān)研究，取得的成果可以通過進(jìn) 一步探索應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。目前"Science"雜志上發(fā)表了擬南芥減數(shù)分裂基因在育種應(yīng) 用上的研究工作，為更好地結(jié)合研究和應(yīng)用開辟了先河。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種水稻OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因在調(diào)控水稻花粉育性 中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自水稻，命名為OsMTOPVIB蛋白，是如下(a)或(b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)?；ǚ塾杂址Q為雄性育性。
[0009] 為了使(a)中的OsMTOPVIB蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0010] 表1標(biāo)簽的序列
[0011]
[0012]~上述(b)中的OsMTOPVIB蛋白可人工合成，也可先合成k編碼基因，再進(jìn)行生物表1 達(dá)得到。上述(b)中的OsMTOPVIB蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中 缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0013] 編碼所述OsMTOPVIB蛋白的基因（OsMTOPVIB基因）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 所述基因?yàn)槿缦拢?)-(4)中任一所述的DNA分子：
[0015] (1)編碼區(qū)如序列表中序列2自5'末端第197至1660位核苷酸所示的DNA分子；
[0016] (2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] (3)在嚴(yán)格條件下與⑴或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花粉育性相關(guān)蛋 白的DNA分子；
[0018] (4)與（1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花粉育性 相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0019] 上述嚴(yán)格條件可為用〇 · 1 X SSPE(或0 · 1 X SSC)，0 · 1 %SDS的溶液，在DNA或者RNA雜 交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0020] 含有所述OsMTOPVIB基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)所述OsMTOPVIB蛋白或其編碼基因在調(diào)控植物雄性育性中的應(yīng)用。 [0022]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為禾本目植物。所述禾 本目植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為稻屬植物。所述稻屬植物具體可為水稻，例 如鹽稻8號水稻。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)一種特異DNA分子，包括如下元件：區(qū)段A、區(qū)段B和區(qū)段C;所述區(qū)段C (間隔序列)位于區(qū)段A和區(qū)段B之間；所述區(qū)段A與所述區(qū)段B反向互補(bǔ);所述區(qū)段A如序列表 中序列3自5'末端第528-827位核苷酸所示。所述特異DNA分子具體可如序列表的序列3所 不。
[0024]所述特異DNA分子轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]本發(fā)明還保護(hù)一種培育雄性不育植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中所 述OsMTOPVIB基因的表達(dá)，得到雄性不育植物。
[0026] 所述"抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表達(dá)"是通過導(dǎo)入所述特異DNA分子 實(shí)現(xiàn)的。
[0027]所述"抑制目的植物中所述OsMTOPVIB基因的表達(dá)"是通過導(dǎo)入干擾載體實(shí)現(xiàn)的； 所述干擾載體含有特異DNA片段(發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA);所述特異DNA片段包括如下元件：區(qū)段A、區(qū) 段B和區(qū)段C;所述區(qū)段C(間隔序列)位于區(qū)段A和區(qū)段B之間；所述區(qū)段A與所述區(qū)段B反向互 補(bǔ);所述區(qū)段A如序列表中序列3自5'末端第528-827位核苷酸所示。所述干擾載體具體可為 在pCAMBIA2300-Actin載體的多克隆位點(diǎn)（具體可為PstI位點(diǎn)）插入序列表的序列3所示的 雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。，
[0028] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中所述 OsMTOPVIB基因的表達(dá)，得到花粉母細(xì)胞的同源染色體不能配對的轉(zhuǎn)基因植物。
[0029] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育雄性不育植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中所 述OsMTOPVIB蛋白的活性，得到雄性不育植物。
[0030] 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為禾本目植物。所 述禾本目植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為稻屬植物。所述稻屬植物具體可為水 稻，例如鹽稻8號水稻。
[0031] 本發(fā)明還保護(hù)OsMTOPVIB蛋白、OsMTOPVIB基因、所述特異DNA分子、所述RNA分子或 以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。
[0032]所述育種的目的為選育雄性不育性的植物。
[0033]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為禾本目植物。所述禾 本目植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為稻屬植物。所述稻屬植物具體可為水稻，例 如鹽稻8號水稻。
[0034]以上任一所述雄性不育性具體體現(xiàn)為不結(jié)實(shí)和/或花粉呈現(xiàn)敗育的表型和/或花 粉母細(xì)胞的同源染色體不能配對和/或花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂終變期有24個單價體。
[0035]本發(fā)明提供了OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因，在水稻的發(fā)育過程中，通過RNA干擾 技術(shù)抑制水稻中OsMTOPVIB蛋白的表達(dá)，可導(dǎo)致水稻花粉敗育。結(jié)合采用組織特異性抑制基 因表達(dá)的方法，OsMTOPVIB基因可以用于水稻雜交種子生產(chǎn)和育性控制，本發(fā)明在水稻育種 上具有重要意義，可以為增加水稻產(chǎn)量、提高水稻品質(zhì)提供重要的生物資源。
【附圖說明】
[0036]圖1為鹽稻8號與水稻不育突變體OsmtopVIB的植株和花粉觀察圖。
[0037] 圖2為OsMTOPVIB基因的組織特異性表達(dá)分析圖。
[0038]圖3為鹽稻8號和水稻不育突變體OsmtopVIB花粉母細(xì)胞中的染色體行為觀察圖。 [0039] 圖4為0sMT0PVIBRNAi干擾植株和水稻不育突變體OsmtopVIB植株染色體行為觀察 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0041 ]中秈3037:參考文獻(xiàn)：Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.， Xue,Y.and Cheng,Z.(2010)DEP and AF0 Regulate Reproductive Habit in Rice.Plos Genetics 6.中秈3037為文中的"Zhongxian 3037"，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物 學(xué)研究所獲得。
[0042]大腸桿菌BL21(DE3):西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品目錄號： CMC0014-4X40UL。
[0043] pUCRNAi載體：參考文獻(xiàn)：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.0sSP011-l isessential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice · Chromosoma · 2010(119): 625-636 ·;公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲 得。
[0044] pCAMBIA2300_Actin載體：參考文獻(xiàn)：Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.OsSPOl1-1 is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice.Chromosoma.2010(119) :625-636.;公眾可從中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0045] 根癌農(nóng)桿菌H1105:北京天恩澤生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號：140383。
[0046]水稻品種鹽稻8號:江蘇省鹽城市明天種業(yè)科技有限公司。
[0047]愈傷誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基（N6D2培養(yǎng)基）：（NH4)2S〇4 463mg，KN03 2830mg，CaCl2 · 2H20 166mg，MgS〇4*7H20 185mg，KH2P〇4 400mg，KI 0.8mg，H3B03 1.6mg，MnS〇4*4H20 4.4mg，ZnS〇4.7H2〇 1.5mg，肌醇 100mg，甘氛酸2mg，煙酸0.5mg，VBl lmg，VB6 0.5mg， ?6304.7出0 27.8!1^，恥240了4.2!120 37.311^，蔗糖3(^，植物膠2.58,2,4-0 211^，水解酪蛋 白0.58，去離子水加至11^，口!1為5.8。
[0048] 農(nóng)桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基（AB液體培養(yǎng)基）：葡萄糖5g，K2HP〇4 3g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2.5mg，NaH2P〇4 lg，NH4Cl lg，MgS〇4.7H20 0.3g，KCl 0.15g，CaCl2 O.Olg，去離子水加至 lL，pH為7.0。
[0049] 農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基(AAM液體培養(yǎng)基）：CaCl2 · 2H20 440mg，MgS〇4 · 7H20 370mg， KH2PO4 170mg，KCl 2940mg，KI 0.83mg，H3B〇3 6.2mg，MnS〇4*4H2〇 22.3mg，ZnS〇4*7H2〇 8.6mg，Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg，CuS〇4 · 5H20 0.03mg，CoCl2 · 6H2O 0.03mg，肌醇lOOmg，甘氨 酸2mg，煙酸0.5mg，VBl lmg，VB6 0.5mg，F(xiàn)eS〇4,7H20 27.8mg，Na2-EDTA，2H2〇 37.3mg，蔗 糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g， 甘氨酸〇. 〇75g，去離子水加至1L，pH為5.2。
[0050] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（N6D2C培養(yǎng)基）：（NH4)2S〇4 463mg，KN03 2830mg，CaCl2 · 2H20 166mg，MgS〇4*7H2〇 185mg，KH2P〇4 400mg，KI 0.8mg，H3B〇3 1.6mg，MnS〇4，4H2〇 4.4mg， ZnS〇4.7H20 1.5mg，肌醇lOOmg，甘氨酸2mg，煙酸0.5mg，VBl lmg，VB6 0.5mg，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.8mg，Na2-EDTA· 2H20 37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖 10g，植物膠2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白 〇.5g，去離子水加至lL，pH為5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮以3)并使其濃度為10(^1。
[0051] 篩選培養(yǎng)基CCD2Sl:NH4N〇3 640mg，KN03 1212mg，CaCl2 · 2H20 588mg，MgS〇4 · 7H20 247mg，KH2P〇4 136mg，KI 0.83mg，H3B〇3 3.1mg，MnS〇4*4H2〇 11.2mg，ZnS〇4*7H2〇 5.76mg， Na2Mo〇4 · 2H20 0.24mg，CuS〇4 · 5H20 0.03mg，CoCl2 · 6H2O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg， 煙酸6mg，VBl 8.5mg，VB6 lmg，F(xiàn)eS〇4,7H20 27.8mg，Na2-EDTA，2H2〇 37.3mg，甘露醇 36.438，鹿糖2(^，植物膠2.58,2,4-0 211^，水解酪蛋白0.58，去離子水加至11^4!1為5.8。倒 平板之前加入G418并使其濃度為100mg/l。
[0052] 篩選培養(yǎng)基CCD2S2:NH4N〇3 640mg，KN03 1212mg，CaCl2 · 2H20 588mg，MgS〇4 · 7H20 247mg，KH2P〇4 136mg，KI 0.83mg，H3B〇3 3.1mg，MnS〇4*4H2〇 11.2mg，ZnS〇4*7H2〇 5.76mg， Na2Mo〇4 · 2H20 0.24mg，CuS〇4 · 5H20 0.03mg，CoCl2 · 6H2O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg， 煙酸6mg，VBl 8.5mg，VB6 lmg，F(xiàn)eS〇4,7H20 27.8mg，Na2-EDTA，2H2〇 37.3mg，甘露醇 36.438，鹿糖2(^，植物膠2.58,2,4-0 211^，水解酪蛋白0.58，去離子水加至11^4!1為5.8。倒 平板之前加入G418并使其濃度為200mg/l。
[0053] 預(yù)分化培養(yǎng)基（CCA培養(yǎng)基）：NH4N〇3 640mg，KN03 1212mg，CaCl2 · 2H20 588mg， MgS〇4*7H20 247mg，KH2P〇4 136mg，KI 0.83mg，H3B03 3.1mg，MnS〇4*4H20 11.2mg，ZnS〇4· 7H20 5.76mg，Na2Mo〇4 · 2H20 0.24mg，CuS〇4 · 5H20 0.03mg，CoCl2 · 6H2O 0.03mg，肌醇90mg， 甘氨酸2mg，煙酸6mg，VBl 8.5mg，VB6 lmg，F(xiàn)eS〇4*7H20 27.8mg，Na2-EDTA*2H2〇 37.3mg， 麥芽糖20g，脫落酸(ABA)5mg，植物膠3g，2，4-D 2mg，6-BA 2mg，萘乙酸(NAA) lmg，水解酪蛋 白0.3g，去離子水加至1L，pH為5.8。倒平板之前加入G418并使其濃度為200mg/l。
[0054] 分化培養(yǎng)基（MSR培養(yǎng)基）：NH4N〇3 1650mg，KN03 1900mg，CaCl2 · 2H20 440mg， MgS〇4*7H20 370mg，KH2P〇4 170mg，KI 0.83mg，H3B03 6.2mg，MnS〇4*4H20 22.3mg，ZnS〇4· 7H20 8.6mg，Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg，CuS〇4 · 5H20 0.03mg，CoCl2 · 6H2O 0.03mg，肌醇 100mg， 甘氨酸2mg，煙酸0.5mg，VBl 0.1mg，VB6 0.5mg，F(xiàn)eS〇4*7H20 27.8mg，Na2-EDTA*2H2〇 37 · 3mg，蔗糖30g，植物膠4g，6-BA 2mg，激動素 (KT)0 · 5mg，水解酪蛋白0 · 3g，萘乙酸(NAA) 0.2mg，玉米素（ZT)0.2mg，去離子水加至lL，pH為5.8。倒平板之前加入6418并使其濃度為 200mg/l〇
[0055] 壯苗培養(yǎng)基：NH4NO3 825mg，KN03 950mg，CaCl2 · 2H20 220mg，MgS〇4 · 7H20 185mg， KH2PO4 85mg，KI 0.83mg，H3B〇3 6.2mg，MnS〇4*4H2〇 22.3mg，ZnS〇4*7H2〇 8.6mg，Na2Mo〇4· 2H20 0.25mg，CuS〇4*5H20 0.03mg，CoCl2*6H20 0.03mg，肌醇 100mg，甘氨酸2mg，煙酸 0.5mg，VBl 0.1mg，VB6 0.5mg，F(xiàn)eS〇4*7H20 27.8mg，Na2-EDTA*2H2〇 37.3mg，蔗糖30g，多 效唑(MET) 6mg，植物膠2g，萘乙酸(NAA) lmg，水解酪蛋白0.3g，去離子水加至1L，pH為5.8。
[0056] 實(shí)施例l、OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因的獲得
[0057] 一、水稻不育突變體OsmtopVIB的獲得及其表型分析和遺傳分析
[0058]以鹽稻8號為出發(fā)植株，構(gòu)建水稻突變體庫。通過篩選水稻突變體庫，獲得一個完 全不育突變體，命名為水稻不育突變體OsmtopVIB。
[0059] 水稻不育突變體OsmtopVIB營養(yǎng)生長正常，和鹽稻8號的營養(yǎng)生長沒有任何差別 (圖1A)，抽穗后，突變體表現(xiàn)不結(jié)實(shí)。對花粉進(jìn)行1%Ι2-ΚΙ染色分析，相比于鹽稻8號中飽滿 圓形的花粉，水稻不育突變體OsmtopVIB的花粉呈現(xiàn)完全敗育的表型（圖1Β)。
[0060] 水稻不育突變體OsmtopVIB和中秈3037進(jìn)行雜交得F1代，F(xiàn)1代種植產(chǎn)生F2代，在分 離出不育突變體的株系中，按單株收獲可育植株的種子，并將這些種子按單株進(jìn)行種植。對 再次分離出不育突變體的株系中的可育植株與不育植株的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，不育株和 可育株的比例為3:1(不育株數(shù)目，117;可育株數(shù)目，43)，表明該不育表型由單隱性基因所 控制(χ 2 = 0·15;Ρ>0·05)。
[0061 ] 二、OsMTOPVIB基因的圖位克隆
[0062]在有不育株分尚的株系中，選擇多株可育的植株與中秈3037進(jìn)行雜交，分單株分 別進(jìn)行編號收取種子，將不同編號種子對應(yīng)種下，并且將雜種F1進(jìn)行播種，根據(jù)不同單株種 子是否有分離來判定上一代植株的基因型是Aa還是AA，將Aa和中秈3037的雜種F1單株收 種，每一株所收取的種子分別種成獨(dú)立的F2小區(qū)，在有分離的F2代小區(qū)中選取不育株，進(jìn)行 基因定位。同時，在F3代或者F4代中選取不育株進(jìn)行精細(xì)定位。通過對F2代200多株不育株 系進(jìn)行連鎖分析，將該基因初步定位在6號染色體S3和S4兩個標(biāo)記之間，大概230kb的區(qū)域 內(nèi)。通過對F3和F4代共700多株不育株進(jìn)行連鎖分析，將該基因精確定位在一個BAC上，大概 39kb范圍內(nèi)。并將該區(qū)域的所有候選基因全部進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只一個基 因內(nèi)發(fā)生了突變。在水稻不育突變體OsmtopVIB的第10個外顯子處，存在G到A的點(diǎn)突變，最 終形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。
[0063] 三、OsMTOPVIB蛋白及其編碼基因的獲得
[0064]提取鹽稻8號的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，分別進(jìn)行0RF擴(kuò)增、5 ' RACE 和3'RACE，拼接后得到全長序列。全長序列編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。
[0065]將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為OsMTOPVIB蛋白，由487個氨基酸殘基組成。 將編碼OsMTOPVIB蛋白的基因命名為OsMTOPVIB基因，OsMTOPVIB基因包含12個外顯子和11 個內(nèi)含子，其開放閱讀框如序列表的序列2自5'末端第197-1660位核苷酸所示。
[0066] 實(shí)施例2、0sMT0PVIB基因表達(dá)分析
[0067] 待測樣本為:鹽稻8號的根、莖、葉片、幼穗。
[0068] 1、提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0069] 2、以步驟1的到的cDNA為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，采用引物RT-F和引物RT-R檢測OsMTOPVIB基因的表達(dá)水平，采用引物Ubi-F和引物Ubi-R檢測內(nèi)參基因（Ubiquitin基 因）的表達(dá)水平。
[0070] RT-F:5 '-GCATTGTTTGGATTGAAAGCA-3 '；
[0071 ] RT-R:5 '-CTAGAAATCGAAAATCATATCCT-3 '；
[0072] Ub i-F:5 '-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3 '；
[0073] Ub i-R:5 '-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3 '。
[0074] Real-time PCR米用SYBR Green I(Invitrogen)嵌合焚光法進(jìn)行，PCR反應(yīng)用Bio-Rad CFX96-real_time RCR儀完成，得到的結(jié)果用Bio-Rad CFX Manager軟件分析。擴(kuò)增反 應(yīng)所用酶為Hot Start Taq聚合酶（TAKARA)。
[0075] 檢測結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，OsMTOPVIB基因在水稻各個組織中均有表達(dá)，葉片 中表達(dá)量最高，其次是幼穗中。
[0076] 實(shí)施例3、0smtopVIB突變體細(xì)胞學(xué)表型分析
[0077]待測樣本為：鹽稻8號減數(shù)分裂時期的幼穗、水稻不育突變體OsmtopVIB減數(shù)分裂 時期的幼穗。
[0078]依次進(jìn)行如下步驟：
[0079] 1、取待測樣本，用卡諾氏固定液(無水乙醇:冰醋酸=3:1;體積比）固定24h。
[0080] 2、用解剖針將花藥撥出至載玻片上，加少許醋酸洋紅，用解剖針迅速將花藥敲碎， 使花粉母細(xì)胞游離出來，蓋上蓋玻片。
[0081 ] 3、取載玻片，在蓋玻片一側(cè)加適量45 %醋酸水溶液，在另一側(cè)放置一張大小合適 的濾紙條，反復(fù)重復(fù)此步驟，直到將載玻片上的醋酸洋紅清除干凈，然后將載玻片放入液氮 中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去蓋玻片。
[0082] 4、取載玻片，依次放入70 %乙醇水溶液、90 %乙醇水溶液和100 %乙醇中浸泡各 5min，進(jìn)行梯度脫水，干燥后滴加4'，6-Diamidino_2-phenylindole(DAPI)，然后用焚光顯 微鏡觀察染色體表型。
[0083]結(jié)果如圖3所示。圖3A為鹽稻8號花粉母細(xì)胞的觀察結(jié)果圖，圖3B為水稻突變體 OsmtopVIB花粉母細(xì)胞的觀察結(jié)果圖。由圖3A可以看到，鹽稻8號花粉母細(xì)胞在細(xì)線期時，染 色體開始濃縮，細(xì)線狀的染色體出現(xiàn);偶線期，同源染色體的配對和聯(lián)會開始進(jìn)行;聯(lián)會復(fù) 合體形成于粗線期;終變期可見12個高度濃縮的二價體；中期I二價體整齊地排布在赤道板 上；后期I和末期I同源染色體均等分離;經(jīng)過減數(shù)分裂II，最終形成四分體。由圖3B可以看 出，水稻突變體OsmtopVIB花粉母細(xì)胞在細(xì)線期，染色體也呈現(xiàn)細(xì)線狀，和鹽稻8號的細(xì)線期 沒有區(qū)別;但是，不同于鹽稻8號的是，偶線期和粗線期沒有觀察到配對和聯(lián)會的染色體，染 色體仍然是單股線狀染色體;在終變期，觀察到24個單價體，而不是鹽稻8號中所觀察到的 12個二價體；中期I，24個單價體散亂分布在細(xì)胞核內(nèi)；后期I和末期I同源染色體不均等分 離，在赤道板位置可見落后染色體；四分體時期觀察到微核的存在。觀察結(jié)果表明該突變體 為不配型突變體。
[0084] 5、使用11號染色體上特異的5S rDNA探針和BAC克隆(a0083M01)探針、端粒特異探 針pAtT4進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)。
[0085]結(jié)果如圖3C所示。在鹽稻8號花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂粗線期，可以檢測到1個5S rDNA和a0083M01探針信號，表明同源染色體配對很好。但是，在水稻突變體OsmtopVIB中，觀 察到2個分離的探針信號，說明OsmtopVIB的突變導(dǎo)致同源染色體不能配對。減數(shù)分裂偶線 期，鹽稻8號花粉母細(xì)胞中，端?？梢院芎玫木奂谝黄?。突變體的花束期表現(xiàn)正常，端粒在 細(xì)胞核內(nèi)同樣呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，結(jié)果說明花束期沒有受到影響。
[0086] 實(shí)施例4、0sMT0PVIB基因功能分析 [0087] 一、構(gòu)建RNAi載體及重組農(nóng)桿菌
[0088] 1、選取鹽稻8號的8mm幼穗，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA。
[0089] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用RNAi-F和RNAi-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0090] RNAi-F:5 '-AGTGGATCCGTTCGCGAGTATGTCCCTGA-3'；
[0091 ] RNAi-R:5 '-GTGTCGACCTAGAAATCGAAAATCATAT-3'。
[0092] RNAi-F和RNAi-R中，下劃線分別標(biāo)注BamHI和SaU酶切位點(diǎn)。
[0093] 3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sal I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0094] 4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail雙酶切pUCRNAi載體，回收約2880bp的載體骨架。
[0095] 5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。
[0096] 6、用限制性內(nèi)切酶Xholl和Bglll雙酶切步驟5的重組質(zhì)粒，然后將載體骨架與步 驟3得到的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒。
[0097] 7、用限制性內(nèi)切酶Pst頂每切步驟6的重組質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物。
[0098] 8、用限制性內(nèi)切酶Pst頂每切pCAMBIA2300-Actin載體，回收10379bp的載體骨架， 將載體骨架去磷酸化。
[0099] 9、將步驟7的酶切產(chǎn)物和步驟8去磷酸化的載體骨架進(jìn)行連接，得到得到RNAi載 體。根據(jù)測序結(jié)果，對RNAi載體進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCAMBIA2300-Actin載體的PstI位點(diǎn) 間插入了序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。RNAi載體可在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的dsRNA，引發(fā)RNAi，從而抑制目的基因 OsMTOPVIB基因的表達(dá)。
[0100] 序列3所示的雙鏈DNA分子包括一個正向序列及其反向互補(bǔ)系列，正向序列如序列 3自5'末端第528-827位核苷酸所示，反向互補(bǔ)序列如序列3自5'末端第15-314位核苷酸所 不。
[0101] 二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻基因轉(zhuǎn)化
[0102] 1、取步驟一得到的RNAi載體，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌H1105,得到重組菌。
[0103] 2、農(nóng)桿菌的培養(yǎng):取步驟1得到的重組菌的單菌落，接種于3mL含50mg/L卡那霉素 和10mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、150rpm振蕩培養(yǎng)16-18h。取培養(yǎng)體系，按照1: 100的體積比接種至農(nóng)桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基中，28°C、150rpm振蕩培養(yǎng)3-5小時至對數(shù)生長 期，離心收集菌體，用含100μ mol/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基重懸，得到OD 6Q()nA〇. 4-0.6的菌懸液。
[0104] 3、誘導(dǎo)水稻愈傷組織(幼胚）：取開花后10天左右的鹽稻8號的種子，先用75%酒精 表面消毒3分鐘，再用含2.5%活性氯的次氯酸鈉(加入2滴Tween-20)浸泡大約90分鐘，每十 分鐘搖動一次，然后用無菌水沖洗5-6次。將種子置于無菌濾紙上，用解剖刀切取幼胚接種 在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)7天。
[0105] 4、侵染:將完成步驟3的愈傷組織浸泡于步驟2制備的菌懸液中，侵染20min，每5分 鐘搖動一次。侵染后將菌懸液倒掉，取愈傷組織，用無菌濾紙吸干水分，然后置于鋪有一層 無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)3天。
[0106] 5、將步驟4共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基CCD2S1上，28°C、暗培養(yǎng)10天，新 長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基C⑶2S2上，28°C繼續(xù)暗培養(yǎng)10天。
[0107] 6、預(yù)分化:將步驟5的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)10天。
[0108] 7、分化:將步驟6預(yù)分化的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上，26°C、光照培養(yǎng)至苗高8cm 左右。
[0109] 8、壯苗:完成步驟7后，取再生苗，置于壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗，26°C、光照培養(yǎng)條 件下培養(yǎng)至生根。
[0110] 9、完成步驟8后，煉苗移入大田，常規(guī)栽培管理。
[0111] 10、采用pCAMBIA2300-Actin載體替代RNAi載體按照步驟1-9進(jìn)行操作。
[0112] 三、轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
[0113] 1、取步驟二的9獲得的植株，提取具有G418抗性的植株的基因組DNA，用 pCAMBIA2300-Act in 的特異引物 23A-F 和 23A-R 進(jìn)行 PCR 鑒定。
[0114] 23A-F:5 '-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3 '；
[0115] 23A-R:5 '-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3 '。
[0116] 可以擴(kuò)出588bp大小條帶的植株為轉(zhuǎn)基因植株，命名為0sMT0PVIBRNAi干擾植株。
[0117] 2、取步驟二的10獲得的植株，提取具有G418抗性的植株的DNA，用pCAMBIA2300-Act in的特異引物23A-F和23A-R進(jìn)行PCR鑒定。
[0118] 23A-F:5 '-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3 '；
[0119] 23A-R:5'-ATCTCCTGTCATCTCACCTT-3'。
[0120]可以擴(kuò)出588bp大小條帶的植株為轉(zhuǎn)空載體植株。
[0121] 四、轉(zhuǎn)基因植株性狀分析
[0122] 待測樣本為：10株野生型植株(鹽稻8號）、10株轉(zhuǎn)空載體植株、10株0sMT0PVIBRNAi 干擾植株和10株突變體OsmtopVIB植株。
[0123] 1、取待測樣本，用卡諾氏固定液(無水乙醇:冰醋酸=3:1;體積比）固定24h。
[0124] 2、用解剖針將花藥撥出至載玻片上，加少許醋酸洋紅，用解剖針迅速將花藥敲碎， 使花粉母細(xì)胞游離出來，蓋上蓋玻片。
[0125] 3、取載玻片，在蓋玻片一側(cè)加適量45 %醋酸水溶液，在另一側(cè)放置一張大小合適 的濾紙條，反復(fù)重復(fù)此步驟，直到將載玻片上的醋酸洋紅清除干凈，然后將載玻片放入液氮 中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去蓋玻片。
[0126] 4、取載玻片，依次放入70 %乙醇水溶液、90 %乙醇水溶液和100 %乙醇中浸泡各 5min，進(jìn)行梯度脫水，干燥后滴加4'，6-Diamidino_2-phenylindole(DAPI)，然后用焚光顯 微鏡觀察染色體表型。
[0127] 結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，0sMT0PVIBRNAi干擾植株和突變體OsmtopVIB植株一致， 各個植株均粗線期染色體不配對，染色體呈現(xiàn)單股現(xiàn)狀結(jié)構(gòu)（圖4A，B)，終變期觀察到24個 單價體（圖4C、D)，野生型植株和轉(zhuǎn)空載體植株粗線期染色體正常配對，終變期可見12個高 度濃縮的二價體。
[0128] 5、觀察野生型植株、轉(zhuǎn)空載體植株及〇810'0?￥181^^干擾植株的生長情況， 0sMT0PVIBRNAl干擾植株均營養(yǎng)生長正常，和野生型植株營養(yǎng)生長沒有任何差別，抽穗后， 0sMT0PVIB RNAi干擾植株均表現(xiàn)為不結(jié)實(shí)。對花粉進(jìn)行1 % I2-KI染色分析，相比于野生型中 飽滿圓形的花粉，0sMT0PVIBRNAl干擾植株的花粉均呈現(xiàn)完全敗育的表型。轉(zhuǎn)空載體植株與 野生型植株的表型一致。
【主權(quán)項】
1. 一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與植物花粉育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦拢?)-(4)中任一所述的DNA分 子： (1) 編碼區(qū)如序列表中序列2自5'末端第197至1660位核苷酸所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； (3) 在嚴(yán)格條件下與（1)或（2)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花粉育性相關(guān)蛋白的 DNA分子； (4) 與（1)或⑵或(3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花粉育性相關(guān) 蛋白的DNA分子。4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或，權(quán)利要求2或3所述基因，在調(diào)控植物雄性育性中的應(yīng)用。6. -種特異DNA分子或所述特異DNA分子轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子;所述特異DNA分子包括如 下元件：區(qū)段A、區(qū)段B和區(qū)段C;所述區(qū)段C位于區(qū)段A和區(qū)段B之間；所述區(qū)段A與所述區(qū)段B 反向互補(bǔ);所述區(qū)段A如序列表中序列3自5'末端第528-827位核苷酸所示。7. -種培育雄性不育植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中權(quán)利要求2或3所述 基因的表達(dá)，得到雄性不育植物。8. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中權(quán)利要求2或3所述基 因的表達(dá)，得到花粉母細(xì)胞的同源染色體不能配對的轉(zhuǎn)基因植物。9. 一種培育雄性不育植物的方法，包括如下步驟:抑制目的植物中權(quán)利要求1所述蛋白 質(zhì)的活性，得到雄性不育植物。10. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或，權(quán)利要求2或3所述基因，或，權(quán)利要求6所述特異DNA分 子或RNA分子，或，權(quán)利要求7-9中任一所述方法，在植物育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK105906697SQ201610471129
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】程祝寬, 薛治慧, 李亞非, 唐丁, 沈懿, 杜桂杰
【申請人】中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所