靶向hsp70基因rna干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及靶向HSP70基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)，針對(duì)HSP70基因的不同靶序列，構(gòu)建了四個(gè)能在293細(xì)胞中表達(dá)siRNA的慢病毒真核表達(dá)載體，干擾慢病毒是由pLv?HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)獲得。本發(fā)明靶向HSP70基因RNA干擾重組慢病毒載體能高效特異性的抑制HSP70基因表達(dá)，可用于制備治療帕金森病或腫瘤相關(guān)性基因藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
革田向HSP70基因 RNA干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及祀向熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)基因的RNA干擾 重組慢病毒載體及其構(gòu)建，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱休克蛋白化eat shock protein，HSP)又稱(chēng)應(yīng)激蛋白，是一類(lèi)廣泛存在于各種 生物體內(nèi)的進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞應(yīng)激蛋白。HSP70是HSP家族中最保守、最主要、含量最 豐富的一種，也是迄今為止研究較多的一種。細(xì)胞在受熱或其他不良因素刺激下發(fā)生應(yīng)激 反應(yīng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP，參與細(xì)胞內(nèi)各種新生膚鏈的結(jié)合、裝配及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。主要作為一種分 子伴侶的作用出現(xiàn)，常常在不同的環(huán)境和病理刺激下產(chǎn)生。其保護(hù)細(xì)胞的功能主要是通過(guò) 促進(jìn)新生膚的折疊W及去除變性的蛋白。在各種腫瘤細(xì)胞中，HSP70通過(guò)抑制調(diào)亡和促進(jìn)腫 瘤細(xì)胞的增值，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的存活和增殖活性增加。研究提示，HSP70表達(dá)的增高與運(yùn)些 腫瘤細(xì)胞的增殖，侵犯，轉(zhuǎn)移W及預(yù)后明顯相關(guān)。
[0003] 帕金森病典型的病理特征是中腦黑質(zhì)多己胺能神經(jīng)元內(nèi)包涵體（inclusion body)-路易體（Lewy body,LB)形成，包涵體內(nèi)聚集了許多異常折疊的蛋白質(zhì)，包括a- synuclein、泛素、氧化硝化蛋白等。目前發(fā)現(xiàn)幾乎所有的神經(jīng)變性疾病都W蛋白質(zhì)聚集物 為病理特征，運(yùn)類(lèi)具有毒性的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺失和神經(jīng)元功能喪失。 有學(xué)者把帕金森W及許多神經(jīng)變性疾病看作為"蛋白質(zhì)構(gòu)象病"，是指由于正常生理功能的 蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象改變而異常聚集所致，如果能夠抑制或逆轉(zhuǎn)此病理過(guò)程，挽救錯(cuò)誤折疊的 蛋白質(zhì)，或許能夠防治和緩解運(yùn)類(lèi)變性疾病。熱休克蛋白由于其具有促使異常蛋白質(zhì)重新 折疊成天然結(jié)構(gòu)而被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解的作用，對(duì)其功能的研究日益受到重視。
[0004] RNA干擾技術(shù)能特異性降解mRNA，沉默祀基因，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)，從 而可用來(lái)進(jìn)行基因功能的研究和藥物祀標(biāo)的研究。RNA干擾機(jī)制研究表明，雙鏈RNA分子首 先被細(xì)胞內(nèi)3魁酶0；[。61'降解成21-23個(gè)堿基大小的小分子干擾1?麻（31]1日11；[]116扣61'；[]1邑 RNA, SiRNA) DSiRNA被認(rèn)為是RNA干擾的主要效應(yīng)物。慢病毒載體作為常用的病毒載體之 一，其特點(diǎn)是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相細(xì)胞，能自身攜帶片段整合入宿主細(xì)胞 基因組，并在哺乳動(dòng)物各類(lèi)細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)SiRNA,長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種祀向服P70基因的RNA干擾重組病毒載體構(gòu)建、篩選及其用途。
[0006] 本發(fā)明WRNA干擾技術(shù)為主，針對(duì)HSP70基因的不同祀序列，構(gòu)建了四個(gè)能在293T 細(xì)胞中表達(dá)SiRNA的慢病毒真核表達(dá)載體pLv-HSP70shRNA，該載體是自身失活的慢病毒載 體，其示意圖譜見(jiàn)圖1，能特異性的抑制服P70基因表達(dá)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種祀向HSP70基因的SiRNA重組慢病毒表達(dá)載體，是用于帕金森病或腫瘤HSP70基因 相關(guān)性治療性物質(zhì)，慢病毒是由9^-冊(cè)?7〇3111?酷、9102.6和95?4乂2載體共轉(zhuǎn)染2931'細(xì)胞培 養(yǎng)獲得;其中，所述的pLv-HSP70shRNA重組載體是在plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中連接雙 鏈DNA片段構(gòu)建而得，酶切位點(diǎn)是BamH巧日EcoRI，所述的雙鏈DNA片段為W下序列中的一種： (1化SP70-hom〇-Sl寡核巧酸序列1: 正義鏈： 5'GATCC ccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTT的' 反義鏈： 5 ' aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2)服P7O-Iiomo-S2寡核巧酸序列2: 正義鏈：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC TTTTTg 反義鏈：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGCG (3化SP70-hom〇-S3寡核巧酸序列3: 正義鏈：GATCCc巧GGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg 反義鏈：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4化SP70-hom〇-S4寡核巧酸序列4: 正義鏈：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC TTTTTg 反義鏈：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。
[000引根據(jù)本發(fā)明，所述的祀向HSP70基因的SiRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包 括步驟如下： a. 根據(jù)HSP70 mRNA序列，設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的HSP70- homo-Sl、服P70-hom0-S2、服P70-hom0-S3 及服P70-hom0-S4 核酸序列中的一種； b. 然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成 pLv-服P70shRNA重組載體； C.再將所述的pLv-服P70shRNA重組載體與pMD2. G和PSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)， 得祀向服P70基因RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。
[0009] 為了對(duì)祀向HSP70基因RNA干擾的重組慢病毒載體對(duì)HSP70基因的抑制效果進(jìn)行鑒 定，將化v-HSP70shRNA與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后進(jìn)行巧光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá) 水平，篩選出有效干擾質(zhì)粒。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為實(shí)施例中慢病毒表達(dá)載體plv-shRNA結(jié)果示意圖。
[0011] 圖2 HSP70干擾RNA慢病毒載體瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞48h圖片（巧光、可見(jiàn)光）。其中（a)為 普通光鏡(IOOX) ;(b)為巧光光鏡(IOOX)。
[0012] 圖3不同干擾序列下的服P70表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0014] 主要材料； 293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;大腸桿菌感受態(tài)D冊(cè)a購(gòu)自北京全式 金生物技術(shù)有限公司；慢病毒載體plv-shRNA購(gòu)自Clontech公司，含有人U6啟動(dòng)子，編碼綠 色巧光蛋白報(bào)告基因；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及化q DNA聚合酶均為美國(guó)肥B 公司產(chǎn)品；SYBR Green I q RT-PCR Mixs購(gòu)與上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；胎牛血清 及DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gib i CO公司。
[0015] 實(shí)施例1祀向服P70基因的慢病毒載體構(gòu)建 1.寡聚核酸的設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)祀向服P70基因(NM_005345.5)的4個(gè)干擾序列(表1)，并合成相應(yīng)的單鏈DNA 車(chē)HSPVO其陽(yáng)RN么不：1#度方Il
ShRNA寡核巧酸的3 '末端是TTTTT，作為RNA聚合酶虹型啟動(dòng)子U6的終止信號(hào)，其5 '和3 ' 末端分別是BamHI和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn)，plv-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了 CTCGAG。 各自單鏈DNA合成片段如下： (1化SP70-hom〇-Sl寡核巧酸序列1: 正義鏈： 5 ' GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGTTTTT的' 反義鏈： 5 ' aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2)服P7O-Iiomo-S2寡核巧酸序列2: 正義鏈：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGCTTTTT邑 反義鏈：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG (3化SP70-hom〇-S3寡核巧酸序列3: 正義鏈：GATCCc巧GGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg 反義鏈：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4化SP70-hom〇-S4寡核巧酸序列4: 正義鏈：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCTTTTT 邑 反義鏈：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。
[0016] 2.寡聚核酸退火 將合成的寡聚核酸分別用無(wú)酶水溶解，濃度為20yM。取相應(yīng)正義鏈和反義鏈溶液，按照 如下配比配制退火反應(yīng)體系：

在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理:95°C 5min; 85°C 5min; 75°C 5min; 70 °C5 min; 4°C 保存。
[0017] 3.pl-shRNA 載體樂(lè)性化 取化g plv-shRNA載體，按照如下體系進(jìn)行酶切處理：
37°C酶切1小時(shí)，1.5%瓊脂糖電泳，使用DNA純化試劑盒回收，核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定 回收質(zhì)量。
[001引 4.plv-服P70-shRNA載體的構(gòu)建 利用T4DNA連接酶，按照如下體系進(jìn)行載體連接反應(yīng)：
20°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化質(zhì)大抽桿菌感受態(tài)D冊(cè)a,挑選陽(yáng)性克隆送去測(cè)序。本步驟得到的產(chǎn) 物是 plv-服 P70-shRNA。
[0019] 實(shí)施例2 RNA干擾慢病毒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞 將4種干擾慢病毒質(zhì)粒，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞采用含10%FBS的 高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天消化293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接 種至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6 X IO5個(gè)細(xì)胞;次日用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基分別配制 巧轉(zhuǎn)試劑和RNA干擾質(zhì)粒，每8化1培養(yǎng)基內(nèi)加入16山巧轉(zhuǎn)試劑，每I(K)山培養(yǎng)基內(nèi)加入化g質(zhì) 粒，分別混勻后將巧轉(zhuǎn)溶液和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，逐滴加入培養(yǎng)皿內(nèi)，在 37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4她，收集 細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。
[0020] 實(shí)施例3總RNA的提取、CDNA的合成及RNA干擾效應(yīng)的RT-PCR檢測(cè) 分別取化g RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用巧光定量PCR法檢測(cè)服P70的表達(dá)水平，Wbe化-actin 作為內(nèi)參，巧光定量PCR所采用的引物探針序列見(jiàn)表2,采用2AAET相對(duì)定量方法計(jì)算不同 RNA干擾序列樣品的HSP70表達(dá)水平。篩選出表達(dá)水平最低的RNA干擾序列。檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖 3)表明S3序列的HSP70表達(dá)水平最低，說(shuō)明S3序列的RNA干擾效果最好，選該序列作為建立 穩(wěn)定細(xì)胞系的干擾序列。 「00211 親9_]1?1~170未化(='1~。-?1。.1~1口弓1物探針1皆奸

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向HSP70基因的SiRNA重組慢病毒表達(dá)載體，是用于帕金森病或腫瘤HSP70基 因相關(guān)治療性物質(zhì)，干擾慢病毒是由口1^-批?70此1?祖、？102.6和?5?4乂2載體共轉(zhuǎn)染2931'細(xì) 胞培養(yǎng)獲得;其中， 所述的pLv-HSP70shRNA重組載體是在pLv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中連接雙鏈DNA片 段構(gòu)建而得，酶切位點(diǎn)是BamHI和EcoRI;所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種： (I )HSP7〇-homo_Sl寡核昔酸序列1: 正義鏈： 5. GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTTg3 ' 反義鏈： 5. aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2) HSP70-hom〇-S2寡核苷酸序列2: 正義鏈：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC ITITTg 反義鏈：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG (3) HSP70-hom〇-S3寡核苷酸序列3: 正義鏈：GATCCcgTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGITTCTCTTGAACTCCTCCACG ITITTg 反義鏈：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4) HSP70-hom〇-S4寡核苷酸序列4: 正義鏈：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC ITITTg 反義鏈：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向HSP70基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 包括步驟如下： a. 根據(jù)HSP70 mRNA序列，設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的批?70_ homo-Sl、批卩70-11〇111〇-52、批？70-11〇111〇-53及邯？70-11〇111〇-54核算序列中的一種 ； b. 然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建成 pLv-HSP70shRNA 重組載體； c. 再將所述的pLv-HSP70shRNA重組載體與pMD2. G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)， 得靶向HSP70基因 RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。3. 權(quán)利要求1所述的靶向HSP70基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體在制備治療帕金森病 或腫瘤相關(guān)性基因藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK105925611SQ201610254028
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】郭佳, 蔣明, 尹衍新, 于麗華, 蔣韻, 王玏
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院