一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP?PCR方法，采用含7種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物和通用引物以適當(dāng)配比參加PCR反應(yīng)，PRV,ASFV,PPV上下游特異性嵌合引物的濃度均為1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特異性嵌合引物的濃度均為1μM，特異性嵌合引物的最佳退火溫度為60℃，通用引物最佳退火溫度為50℃。本發(fā)明改善了多重PCR過(guò)程中不同靶基因的擴(kuò)增偏好性，從而提高目的基因的檢測(cè)效率，提高了檢測(cè)的特異性，大大提高了分辨率和靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)豬繁殖障礙病毒的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于繁殖障礙病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多 重GeXP-PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重GeXP-PCR技術(shù)是一種基于多重PCR技術(shù)、毛細(xì)管電泳分離技術(shù)與高靈敏激光誘 導(dǎo)熒光技術(shù)而開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種檢測(cè)分析系統(tǒng)。它將熒光標(biāo)記的通用引物與特異嵌合引物按 一定比例同時(shí)加入一個(gè)PCR反應(yīng)體系，利用反應(yīng)中占主導(dǎo)地位的通用引物引發(fā)擴(kuò)增來(lái)避免 擴(kuò)增中所產(chǎn)生的偏愛(ài)性問(wèn)題，并用毛細(xì)管電泳對(duì)多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)片段大小分離 不同基因，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度不同顯示模板含量的差別，在很大程度上提高了檢測(cè)的靈敏 度和速度，并且僅用極少量總RNA(20ng)即可在同一個(gè)體系里對(duì)多達(dá)40個(gè)目的基因進(jìn)行有 效分析。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，旨在改善 多重PCR過(guò)程中不同靶基因的擴(kuò)增偏好性，提高目的基因的檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)豬繁殖障礙病毒 的快速檢測(cè)。
[0004] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，所述檢測(cè) 豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV， PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物和通用引物以適當(dāng)配比參加 PCR反應(yīng)，PRV，ASFV，PPV上下 游特異性嵌合引物的濃度均為1.5μΜ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物的濃度 均為ΙμΜ，特異性嵌合引物的最佳退火溫度為60°C，通用引物的最佳退火溫度為50°C。
[0005] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步驟：
[0006] 待測(cè)樣品制備，按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取患病動(dòng)物的組織 或病毒的細(xì)胞增殖液的全基因組，若為RNA病毒則進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備用于檢測(cè)的cDNA;
[0007] PCR擴(kuò)增：25yL PCR反應(yīng)液包含:ExTaq酶 12.5yL、引物Mix 9yL、待測(cè)樣品DNA lyL、 無(wú)核酸酶滅菌水2.5μΜ其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特異性嵌合引物各 1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9μ L；
[0008] 按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：95 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 25s，12個(gè)循環(huán)；95 °C 30s，50 °C 30s， 72°〇258,20個(gè)循環(huán)；721€511^11;
[0009] 毛細(xì)管電泳:取ΙμL 10倍稀釋了的PCR產(chǎn)物加入到預(yù)先配置好的39μ1上樣緩沖液 中（38.75μ1 SLS+0.25μ1 DSS-400)，混勻過(guò)后再每孔上方滴一滴礦物油以防止液體政法所 帶來(lái)的交叉污染，最后再在上樣緩沖板對(duì)應(yīng)的孔中加入大約250μ1的分離緩沖液，準(zhǔn)備完成 后放入GenomeLabTM GeXP System選擇Frag-3分離方法進(jìn)行多重基因表達(dá)系統(tǒng)毛細(xì)管電泳 分析；
[0010]使用自定義GeXP片段分析參數(shù)對(duì)分離后的片段分析，判定結(jié)果。
[0011] 進(jìn)一步，所述7種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV 嵌合引物的序列如下：
[0026] 進(jìn)一步，所述7種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV 嵌合引物的各條帶大小如下：PRV:156-160bp，CSFV:195-196bp，ASFV:227-288bp，PRRSV: 258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:36〇-361bp〇
[0027]進(jìn)一步，所述檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法：
[0028] 對(duì)PRV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ;
[0029] 對(duì)CSFV的最低檢測(cè)量為102copiesAU ;
[0030] 對(duì)ASFV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ;
[0031] 對(duì)PRRSV的最低檢測(cè)量為102copiesAU ;
[0032] 對(duì)PPV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ;
[0033] PCV2的為 102copiesAU，JEV的為 103copiesAU ;
[0034] 當(dāng)7種病毒同時(shí)存在時(shí)，最低檢測(cè)限度為lOOOcopies/μΙ。
[0035]本發(fā)明提供的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，能在一個(gè)反應(yīng)中方便快 速地同時(shí)檢測(cè)7種相關(guān)病毒，為豬繁殖障礙病毒的快速鑒別診斷提供了技術(shù)支持，對(duì)疾病的 預(yù)防控制提供了理論依據(jù)。本方法采用含7種豬繁殖障礙病毒靶基因的嵌合引物和通用引 物以適當(dāng)配比參加 PCR反應(yīng)(通用引物在PCR擴(kuò)增過(guò)程中起主導(dǎo)作用），改善了多重PCR過(guò)程 中不同靶基因的擴(kuò)增偏好性，從而提高目的基因的檢測(cè)效率;根據(jù)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物片段 長(zhǎng)度來(lái)確定目的片段，提高了檢測(cè)的特異性;采用毛細(xì)管電泳對(duì)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分 離和檢測(cè)，大大提高了分辨率和靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)豬繁殖障礙病毒的快速檢測(cè)。本發(fā)明具有 良好的方法學(xué)特征:建立了 一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和節(jié)時(shí)省力的GeXP-PCR檢測(cè) 方法;為混合感染疾病的同步檢測(cè)和鑒別診斷提供快速、高效的手段，為今后出入境動(dòng)物檢 疫和相應(yīng)疫病控制提供了技術(shù)保障;對(duì)滿(mǎn)足進(jìn)出境動(dòng)物檢疫工作的需要，控制繁殖障礙病 病毒的傳播，保障我國(guó)的畜牧業(yè)安全、健康發(fā)展具有十分重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的操作流程圖。
[0037]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的單重GeXP-PCR引物特異性驗(yàn)證 結(jié)果圖；
[0038] 圖中：&、卩1^:156-16(^口；13、〇5卩￥:195-196匕口；。、八5卩￥:227-288匕口 ；(1、？1?1?￥:258-261 bp; e、PPV: 284-285bp; f、PCV2:337-341 bp; g、JEV: 360-361 bp ;h、陰性對(duì)照。
[0039] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的在多引物體系中每個(gè)反應(yīng)無(wú)交叉反應(yīng)性示意圖；
[0040] 圖中：a、模板為 PRV+CSFV+PRRSV+PCV2+JEV; b、模板為 CSFV+ASFV+PRRSV+PCV2; c、 模板為 CSFV+PRRSV+PCV2; d、模板為 CSFV+ASFV。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0042] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0043]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下 步驟：
[0044] S101:待測(cè)樣品制備，按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取患病動(dòng)物的 組織或病毒的細(xì)胞增殖液的全基因組，若為RNA病毒則進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備用于檢測(cè)的cDNA;
[0045] S102:PCR擴(kuò)增：25yL PCR反應(yīng)液包含，ExTaq酶 12.5yL、引物Mix 9yL、待測(cè)樣品DNA lyL、無(wú)核酸酶滅菌水2.5yL;其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特異性嵌合引物 各1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9 yL；
[0046] 5103:按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：951€308,601€308,72 1€258，12個(gè)循環(huán)；951€308,501€ 30s，72 °C 25s，20 個(gè)循環(huán)；72 °C 5min;
[0047] S104:毛細(xì)管電泳：取ΙμL 10倍稀釋了的PCR產(chǎn)物加入到預(yù)先配置好的39μ1上樣 緩沖液中（38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混勻過(guò)后再每孔上方滴一滴礦物油以防止液體 政法所帶來(lái)的交叉污染，最后再在上樣緩沖板對(duì)應(yīng)的孔中加入大約250μ1的分離緩沖液，準(zhǔn) 備完成后放入GenomeLabTM GeXP System選擇Frag-3分離方法進(jìn)行多重基因表達(dá)系統(tǒng)毛細(xì) 管電泳分析；
[0048] S105:使用自定義GeXP片段分析參數(shù)對(duì)分離后的片段分析，判定結(jié)果。
[0049] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0050] 1.材料和方法
[0051 ] 1.1.病毒
[0052] ASFV是由人工合成的質(zhì)粒，其他陽(yáng)性樣本和陰性樣本見(jiàn)表1，所有的疫苗都來(lái)自于 商業(yè)資源。
[0053] 表1.樣本來(lái)源和GeXP實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0056] PRV:Pseudorabies；CSFV:Classical Swine Fever Virus；ASFV:African Swine Fever Virus；PRRSV:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus；PPV: Porcine Parvovirus；PCV2:Porcine Circovirus type 2；JEV:Japanese Encephalitis Virus.SAU:Sichuan Agricultural University；MVRI:Military Veterinary Research Institute；NAFU:Northwest A&F University.
[0057] 1.2.主要試劑及儀器
[0058] 1.3.主要試劑:克隆宿主菌E.coli DH5a由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供;蛋 白酶K購(gòu)于Sigma公司；Premix Taq、DL2000 DNAMarker、pMD19_T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自 TaKaRa公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest; GenomeLab? Separation Gel、GenomeLab? GeXP Start Kit、 GenomeLab? Separation Buffer、GenomeLab Sample Loading Solution、DNA Size Standard_400and Mineral Oil 購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0059]主要儀器:凝膠成像系統(tǒng)和梯度PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)BI0-RAD有限公司；GenomeLab? GeXP遺傳分析系統(tǒng)，美國(guó)Beckman公司；高速冷凍離心機(jī)，Heraens有限公司；DYY-7C電泳儀 和電泳槽，北京市六一儀器廠等。
[0060] 1.3核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0061] 按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取患病動(dòng)物的組織或病毒的細(xì)胞增 殖液的全基因組，若為RNA病毒則進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備用于檢測(cè)的cDNA。
[0062] 反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)在10μ1體系中進(jìn)行：2μ1 5 X PrimeScript buffer(包括dNTP Mixture和Mg+)，0.5yl PrimeScript RT Enzyme Mix I，25pmol Oligo dT Primer，200pmol Random 6mers，3yl模板，2μ1 RNase Free dH2〇。在PCR儀上37°C反應(yīng) 15min，然后再 85°C 反應(yīng) 5seC(3cDNA 保存在-20°C〇
[0063] 1.4臨床樣本，臨床病料來(lái)自四川齊全等豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒，共58份，包括肝臟、 脾臟、肺臟、腎臟等均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存(表1)。
[0064] 1.5.GeXP_PCR 引物的設(shè)計(jì)
[0065] 參照GenBank中PRV gB(JF797219)、CSFV E2(KC533781)、ASFV P72(AY578708)、 PRRSV(AY262352)、PPVNS1(AY583318)、PCV20RF1(AY678532)和JEVE(M55506)基因組序 列，選取保守序列，借助DNAStar和Oligo 6.0軟件，設(shè)計(jì)7對(duì)引物特異性引物，再將一段通用 (非同源性序列）引物標(biāo)簽（TagF : 5 ' -AGGTGACACTATAGAATA-3 ' · TagR : 5 ' -GTACGACTCACTATAGGGA-3 '）分別加在各病毒特異性引物的5 '，構(gòu)成特異性嵌合引物。上游通 用引物的5 '用Cy5進(jìn)行標(biāo)記，引物由上海生工合成(表2)。
[0066] 表2.GeXP引物信息
[0068] 注:下劃線表示的是通用引物.
[0069] 1.5.測(cè)序
[0070]用不含有通用序列的特異性引物分別擴(kuò)增7種陽(yáng)性樣本的DNA/cDNA，ddH20為陰性 對(duì)照，進(jìn)行擴(kuò)增單重PCR擴(kuò)增。用E.Z.N.A.TM膠回收試劑盒(0MEGA)，按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟 回收擴(kuò)增片段，純化回收的目的片段與PMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化于DH5a受體菌中。陽(yáng)性克隆 產(chǎn)物擴(kuò)大培養(yǎng)后送交寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果用DNASTAR software進(jìn)行分析，并GenBank登錄的各病毒的基因序列進(jìn)行比對(duì)。其結(jié)果顯示各病毒基因 序列與NCBI中登錄的各病毒基因序列的核苷酸同源性均高達(dá)99%。
[0071] 2.1.單重 GeXP-PCR 實(shí)驗(yàn)
[0072]以DNA/cDNA為模板進(jìn)行單重GeXP-PCR反應(yīng)，確定各靶基因的實(shí)際檢測(cè)大小。在整 個(gè)實(shí)驗(yàn)中都以無(wú)核酸酶的水為空白對(duì)照，將特異性嵌合引物稀釋至lyM，Cy5_Tag F和Tag R 稀釋至ΙΟμΜ，采用25μ1 PCR反應(yīng)體系在Thermo PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增(表3)。
[0073] 取ΙμL 10倍稀釋了的PCR產(chǎn)物加入到預(yù)先配置好的39μ1上樣緩沖液中（38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混勻過(guò)后再每孔上方滴一滴礦物油以防止液體政法所帶來(lái)的交叉 污染，最后再在上樣緩沖板對(duì)應(yīng)的孔中加入大約250μ1的分離緩沖液，準(zhǔn)備完成后放入 GenomeLab? GeXP System選擇Frag-3分離方法進(jìn)行多重基因表達(dá)系統(tǒng)毛細(xì)管電泳分析。毛 細(xì)管電泳結(jié)束后，使用自定義GeXP片段分析參數(shù)對(duì)分離后的片段分析，以確定各靶基因?qū)?應(yīng)的實(shí)際檢測(cè)長(zhǎng)度(信號(hào)值超過(guò)2000A.U.即為陽(yáng)性）。
[0074]表3. PCR反應(yīng)體系及條件
[0076] 2 · 2 ·多重GeXP-PCR檢測(cè)體系的建立及優(yōu)化
[0077]用已經(jīng)確定的病毒核酸作為模板，無(wú)核酸酶的水為空白對(duì)照。等量混合各特異性 嵌合引物，使其工作濃度為ΙμΜ，其余反應(yīng)條件同單重GeXP-PCR，建立多重GeXP-PCR檢測(cè)反 應(yīng)體系。
[0078] 調(diào)節(jié)各重組質(zhì)粒的濃度，以7種病毒的重組質(zhì)?；旌衔?各病毒質(zhì)粒濃度一致)為 模板，以改變某一參數(shù)固定其它參數(shù)的方式分別對(duì)多重GeXP-PCR檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng) 條件中退火溫度最為重要，本實(shí)驗(yàn)以57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C為退火溫度，做梯 度PCR以確定最佳退火溫度。多重GeXP-PCR反應(yīng)體系中各特異性嵌合引物的濃度與比例至 關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)涉及兩種引物，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通用引物的濃度變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，故 將其固定為20μΜ，針對(duì)各病毒嵌合引物設(shè)計(jì)一個(gè)正交實(shí)驗(yàn)，用以確定各病毒特異性嵌合引 物的最佳濃度比。
[0079] 取ΙμL 10倍稀釋了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行多重基因表達(dá)系統(tǒng)毛細(xì)管電泳分析。毛細(xì)管電 泳結(jié)束后，使用自定義GeXP片段分析參數(shù)對(duì)分離后的片段分析，以確定各靶基因?qū)?yīng)的實(shí) 際檢測(cè)長(zhǎng)度(信號(hào)值超過(guò)2000A. U.即為陽(yáng)性）。
[0080] 2.3GeXP多重PCR反應(yīng)特異性及靈敏度
[0081] 根據(jù)多重反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果，配制多重混合引物工作液，用建立的GeXP多重檢測(cè) 體系分別對(duì)表1中的各陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證GeXP多重 PCR檢測(cè)體系的特異性；以隨機(jī)混合的帶目的片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，測(cè)其交 叉反應(yīng)性。
[0082] 將含有各病毒目的片段的克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋至：105拷貝/μ1，104拷 貝/μL，1〇 3拷貝/μL，1〇2拷貝/μL，101拷貝/μL，先進(jìn)行GeXP單重PCR擴(kuò)增，觀察其最低檢測(cè)限， 再以各梯度等比混合液為模板，用最優(yōu)的GeXP多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增，觀察其最低檢測(cè)限。
[0083] 2.4臨床樣本的檢測(cè)
[0084] 對(duì)58份已通過(guò)國(guó)標(biāo)驗(yàn)證為陽(yáng)性的臨床樣品進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測(cè)（表1 )，并對(duì)兩 者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
[0085] 3 結(jié)果
[0086] 3 · 1單重 GeXP-PCR 實(shí)驗(yàn)
[0087] 在單重GeXP-PCR實(shí)驗(yàn)中，每對(duì)特異性引物都能擴(kuò)增出相應(yīng)地目的片段，陰性樣本 擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，各條帶大小如下:PRV:156-160bp，CSFV:195-196bp，ASFV:227-288bp, PRRSV:258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:360-361bp(圖 2)
[0088] 3 · 2多重GeXP-PCR檢測(cè)體系的建立及優(yōu)化
[0089] 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:PRV，ASFV，PPV上下游特異性嵌合引物的最適濃度均為1.5μ Μ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物的最適濃度均為ΙμΜ，上下游通用引物為20 μΜ。特異性嵌合引物的最佳退火溫度為60°C，通用引物的最佳退火溫度為50°C。
[0090] 3.3GeXP多重PCR反應(yīng)特異性及靈敏度
[0091] 在多引物體系中，每個(gè)反應(yīng)只出現(xiàn)特異性信號(hào)，并且無(wú)交叉反應(yīng)性(圖3)
[0092] GeXP單重PCR靈敏度結(jié)果顯示，對(duì)PRV的最低檢測(cè)量為103copiesAU，對(duì)CSFV的最 低檢測(cè)量為102copiesAU，對(duì)ASFV的最低檢測(cè)量為103copiesAU，對(duì)PRRSV的最低檢測(cè)量為 102copiesAU，對(duì)PPV的最低檢測(cè)量為 103copiesAU，PCV2的為 102copiesAU，JEV的為 103copiesAU。當(dāng)7種病毒同時(shí)存在時(shí)，GeXP多重PCR的最低檢測(cè)限度為lOOOcopies/μΙ。 [0093] 3.3臨床樣本的檢測(cè)
[0094]通過(guò)對(duì)已驗(yàn)證為陽(yáng)性的58份臨床樣品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與國(guó)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致 (表1 )，本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)出7種病原體，在節(jié)約人力、物力的同時(shí)能夠快速對(duì)臨床樣本作出 診斷。
[0095]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述檢測(cè)豬繁殖障礙 病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV， PCV2，JEV嵌合引物和通用引物以適當(dāng)配比參加 PCR反應(yīng)，PRV，ASFV，PPV上下游特異性嵌合 弓丨物的濃度均為1.5μΜ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物的濃度均為ΙμΜ，特異 性嵌合引物的最佳退火溫度為60°C，通用引物的最佳退火溫度為50°C。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述檢 測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步驟： 待測(cè)樣品制備，按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取患病動(dòng)物的組織或病 毒的細(xì)胞增殖液的全基因組，若為RNA病毒則進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備用于檢測(cè)的cDNA; PCR擴(kuò)增：25yL PCR反應(yīng)液包含:ExTaq酶12.5yL、引物Mix 9yL、待測(cè)樣品DNA lyL、無(wú)核 酸酶滅菌水2.5yL;其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特異性嵌合引物各1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特異性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9yL; 按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：951€3〇8,6〇1€3〇8,721€258，12個(gè)循環(huán) ；951€3〇8,5〇1€3〇8,721€ 258,20個(gè)循環(huán)；721€511^11; 毛細(xì)管電泳：取ΙμL 10倍稀釋了的PCR產(chǎn)物加入到預(yù)先配置好的39μ1上樣緩沖液中 (38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混勻過(guò)后再每孔上方滴一滴礦物油以防止液體政法所帶 來(lái)的交叉污染，最后再在上樣緩沖板對(duì)應(yīng)的孔中加入大約250μ1的分離緩沖液，準(zhǔn)備完成后 放入GenomeLabTM GeXP System選擇Frag-3分離方法進(jìn)行多重基因表達(dá)系統(tǒng)毛細(xì)管電泳分 析； 使用自定義GeXP片段分析參數(shù)對(duì)分離后的片段分析，判定結(jié)果。3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7 種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物的序列如下： PRV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGGGTTGGACAGGAAGGA R:GTACGACTCACTATAGGGAGCATCGCCAACTTCTTCCA CSFV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGCCTCACCACTACGTGGA R:GTACGACTCACTATAGGGAAGGTGGGTAGAGCCCTCTTA ASFV F:AGGTGACACTATAGAATATGGCCCTCTCCTATGCAA R:GTACGACTCACTATAGGGATGCGTCCGTAATAGGAGT PRRSV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTCCAGATGCCGTTTGT R:GTACGACTCACTATAGGGAACAAGGTTTACCACTCCCT PPV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTAAGTCCAAGTGACTGCT R:GTACGACTCACTATAGGGATAGGTTAGTAGCGATACCCA PCV2F:AGGTGACACTATAGAATATGCAGAAGCGTGATTGGAAGA R:GTACGACTCACTATAGGGAACGGGGTCTGATTGCTGGTA JEV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGAGCCATCGTGGTGGAGT R:GTACGACTCACTATAGGGATCCATCTCGACCAGCACCT 〇4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7 種豬繁殖障礙病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物的各條帶大小 如下：PRV: 156-160bp，CSFV: 195-196bp，ASFV: 227-288bp，PRRSV: 258-26lbp，PPV: 284- 285bp,PCV2:337-341bp and JEV:36〇-361bp〇5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述檢 測(cè)豬繁殖障礙病毒的多重GeXP-PCR方法： 對(duì)PRV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ; 對(duì)CSFV的最低檢測(cè)量為102copiesAU ; 對(duì)ASFV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ; 對(duì)PRRSV的最低檢測(cè)量為102copiesAU ; 對(duì)PPV的最低檢測(cè)量為103copiesAU ; PCV2的為 102copiesAU，JEV的為 103copiesAU ; 當(dāng)7種病毒同時(shí)存在時(shí)，最低檢測(cè)限度為lOOOcopies/μΙ。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK105969910SQ201510996088
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年12月25日
【發(fā)明人】王印, 胡凌, 楊澤曉, 姚學(xué)萍, 林星宇, 鄔旭龍, 李桂黎, 任梅滲, 肖璐, 張鵬飛, 曾相杰, 冷伊依
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)