黃瓜花葉病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】一種黃瓜花葉病毒RT?LAMP檢測試劑盒及檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris?HClpH7.5構(gòu)成的快速提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板；S2使用設(shè)計的上游引物、下游引物及環(huán)引物，構(gòu)建RT?LAMP反應(yīng)體系；S3將所述RT?LAMP反應(yīng)體系，置于65℃水域中，反應(yīng)60分鐘，得到反應(yīng)液；S4對所述反應(yīng)液進(jìn)行檢測。
【專利說明】
黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法，具體涉及雀麥花 葉病毒科黃瓜花葉病毒屬黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)RT_LAMP引物組的 建立，CMV RT-LAMP檢測試劑盒的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜花葉病毒(CMV)是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬代表種，為三分體基因組 和一個亞基因組，均為正單鏈RNA病毒，RNA1長3357bp，RNA2長3050bp，RNA3長2216bp，RNA4 為RNA3的亞基因組，長1000bp<XMV是一種非常嚴(yán)重的病毒病害，病毒可達(dá)到除生長點以外 的任何部位。該病毒寄主范圍多、分布廣，具經(jīng)濟重要性的植物病毒之一，能侵染1000多種 雙子葉和單子葉植物。CMV可由60多種蚜蟲以非持久方式傳播，易機械接種傳播，是我國十 字花科、茄科、豆科及萌蘆科蔬菜上最主要的病院病毒，也是煙草、香蕉、西番蓮的重要病 原，我國已從38個科的120多種植物上分離到CMV。
[0003] 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根 據(jù)目的基因的6個特異區(qū)域，設(shè)計4-6條特異性引物，利用Bst DNA聚合酶在60~65°C等溫條 件下特異地擴增目的基因。LAMP擴增反應(yīng)可在60分鐘之內(nèi)完成，其擴增產(chǎn)物是和靶標(biāo)反向 重復(fù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及多環(huán)的菜花樣結(jié)構(gòu)，反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，并形成焦磷 酸鎂白色沉淀。LAMP方法可以通過多種方法判斷結(jié)果，如反應(yīng)后體系內(nèi)是否存在白色沉淀 物、電泳結(jié)果是否具有梯狀條帶、加入SYBR Green I是否變成綠色等，具有檢測靈敏度高， 檢測方法簡單快速、儀器要求不高等特點。然而就引物設(shè)計方面，目前報道的文獻(xiàn)多是以在 線方式(Primer Explore)設(shè)計引物，應(yīng)用范圍受到限制，根據(jù)LAMP原理自行設(shè)計多組引物 組，通過實驗結(jié)果選取最適引物組，構(gòu)建LAMP檢測方法，這樣將會大大增加 LAMP的適用范 圍，具有更為廣泛的應(yīng)用前景。
[0004] 自LAMP技術(shù)建立以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對病菌、寄生蟲等的檢測，近年來在 動物病毒的檢測研究中逐漸推廣起來，然而對于植物病毒如黃瓜花葉病毒還沒有相應(yīng)的檢 測試劑盒的報道，因此開發(fā)一種針對黃瓜花葉病毒的RT-LAMP試劑盒具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] CMV 檢測主要有 0了81八』1^八、1?1'-?〇?、1?1'-1168七6(1?〇?、代31-^1116 1?1'-?〇?等方法。 DTBIA靈敏度較低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸檢測技術(shù)需要昂貴 的專業(yè)儀器，且核酸擴增的時間較長。
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速黃瓜花葉病毒 RT-LAMP檢測方法。本發(fā)明人在堅持不懈的努力之下，發(fā)明了一種快速提取RNA待測樣品的 方法，并結(jié)合自己設(shè)計的引物，使用RT-LAMP檢測方法，能夠快速有效地檢測出黃瓜花葉病 毒。
[0007] 本發(fā)明提供
[0008] (1) 一種黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述 RT-LAMP引物為：
[0009]
[001 0] (2)如（1)所述的試劑盒，還包括黃瓜花葉病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取 液由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成。
[0011] (3)如(2)所述的試劑盒，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6%。
[0012] 本發(fā)明還提供如下檢測黃瓜花葉病毒的方法，
[0013] (4) 一種黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟
[0014] S1使用由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成的 快速提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板；
[0015] S2使用如（1)所述試劑盒，構(gòu)建RT-LAMP反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系為20yL，包括:2 X 反應(yīng)緩沖液(1?〇1(^1^，酶溶液化]\〇0.841^，40?111〇1/^上游引物卩1?0.841^，40?111〇1/^上游引 物81?0.841^，1(^111〇1/^1^下游引物卩3 0.441^，1(^111〇1/^1^下游引物83 0.441^，濃度均為 20pmolAiL的環(huán)引物L(fēng)B0 · 8yL，RNA 模板 1 · 6yL，及去離子水(DW) 4 · 4yL;
[0016] S3將所述RT-LAMP反應(yīng)體系，置于65°C水域中，反應(yīng)60分鐘，得到反應(yīng)液；
[0017] S4對所述反應(yīng)液進(jìn)行檢測。
[0018] (5)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6%。
[0019] (6)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中所述S4步驟中是在所述反應(yīng)液中加入加 入鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，通過反應(yīng)管內(nèi)所產(chǎn)生的顏色變化判斷檢測結(jié)果。
[0020] 本發(fā)明根據(jù)CMV的基因序列設(shè)計RT-LAMP引物，通過實驗最終建立了 CMV的RT-LAMP 檢測方法，為CMV的檢測提供了 一種快速高效、特異靈敏的新方法，靈敏度高，比普通RT-PCR 靈敏度高10倍;并可通過肉眼觀察濁度或顏色反應(yīng)直接進(jìn)行結(jié)果判斷。該方法適用于現(xiàn)場 CMV的快速檢測。本研究的目的就是研制該病毒的快速高效、靈敏特異的檢測技術(shù)，與以往 研究的方法形成一個不同層次的檢測體系，使檢測人員根據(jù)不同條件和目的可以進(jìn)行廣泛 有效的選擇，為黃瓜種苗檢驗檢疫及生產(chǎn)田的病害監(jiān)測提供有效的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0021] 圖1最佳反應(yīng)溫度擴增曲線。
[0022]圖2特異性實驗中擴增曲線結(jié)果。
[0023 ]圖3特異性試驗中顏色反應(yīng)結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024]為解決上述技術(shù)問題，設(shè)計1套用于檢測CMV的引物組，包括正向外引物F3-1的序 列為SEQ ID N0.1，反向外引物B3-1的序列為SEQ ID N0.2;正向內(nèi)引物FIP-1的序列為SEQ IDN0.3，反向內(nèi)引物BIP-1的序列為SEQIDN0.4;以及環(huán)引物L(fēng)B，具體序列見表1。
[0025] 表1引物序列
[0026]
[0027] Loopamp RNA擴增反應(yīng)試劑盒、Loopamp反應(yīng)管、Loopamp FD焚光檢測試劑購自日 本榮研化學(xué)株式會社，RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為常 規(guī)分析純試劑。采用日本榮研化學(xué)株式會社生產(chǎn)的LA-320C實時濁度儀。
[0028]試驗例1核酸提取
[0029] 分別稱取感染CMV病毒或未感染的（對照用）的黃瓜葉片O.lg，或者用鑷子獲取相 當(dāng)于0. lg大小的黃瓜葉片作為實驗用材料。
[0030] RNA提取方法1:使用RNA快速提取試劑盒（離心柱型）提取樣品總RNA，具體操作按 試劑盒說明進(jìn)行。本試驗具體使用了QIAGEN Rneasy Mini kit提取RNA，也可以采取其它試 劑盒進(jìn)行提取，或者通常實驗室提取方法提取RNA。
[0031] RNA提取方法2:采用本發(fā)明的試劑盒，更加快速簡便地提取RNA粗提液。具體是用 鑷子取黃瓜新生葉片約〇.lg，迅速置于研砵中，研砵中預(yù)先加入含有10%的乙酸乙酯、2~ 10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成的提取液5mL，并迅速研磨3min，然后靜置 2min，取1.6yL作為RNA模板。所述鑷子、研砵、研磨棒及其它試驗用具需要在DEPC水中浸泡 12小時后，150度烘烤6小時，然后取出放置于4°C冷藏備用。含有10%的乙酸乙酯、2~10% 的二甲基甲硫胺的1M Tris-HClpH7.5溶液為事先配好，高溫高壓消毒處理后，放置于4°C冷 藏備用。移液搶的槍頭以及各種反應(yīng)管均使用RNA酶free產(chǎn)品。
[0032]所述10%的乙酸乙酯的濃度是指100ml溶液中，含有10g乙酸乙酯，二甲基甲硫胺 的濃度同樣。
[0033]試驗例2RT-LAMP體系的建立及優(yōu)化
[0034] RT-LAMP反應(yīng)體系按照Loopamp RNA擴增試劑盒說明，反應(yīng)體系為20yL，包括：2X 反應(yīng)緩沖液(RM) 1 OyL，酶溶液(EM) 0 · 8yL，40pmo 1 /yL 引物FIP 0 · 8yL，40pmo 1ΛΛ BIP0 · 8yL， lOpmol/yL F3 0.4yL，10pmolAxL B3 0.4yL，LB(濃度均為20pmolAiL)0.8yL，RNA模板 1·6μ L，及去離子水(DW)4.4yL。反應(yīng)溫度分別設(shè)為59、61、63和65°(：，反應(yīng)時間為6〇11^11。擴增反應(yīng) 在實時濁度儀上進(jìn)行，根據(jù)60min內(nèi)出現(xiàn)擴增曲線的最短時間確定最佳反應(yīng)溫度。
[0035] 黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草脈帶花葉病毒 (TVBMV)及陰性對照(NC)的總RNA和水(作為空白對照，用BC表示)為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)， 體系中同時加入l.〇yL鈣黃綠素?zé)晒馊玖希碙oopamp Π )熒光檢測試劑），驗證該方法的特 異性。
[0036] RT-LAMP擴增產(chǎn)物（1)實時擴增曲線檢測:擴增進(jìn)行時，如果有產(chǎn)物出現(xiàn)，反應(yīng)液會 產(chǎn)生一定的濁度；濁度儀會將濁度信號收集，以擴增曲線的形式反映，從而對結(jié)果進(jìn)行判 斷。（2)染料顏色反應(yīng)檢測:在LAMP反應(yīng)體系中加入lyL Loopamp FD試劑，反應(yīng)結(jié)束后，肉眼 觀察反應(yīng)液的熒光顏色反應(yīng)。顯綠色判斷為陽性反應(yīng);若顯橙色判斷為陰性反應(yīng)。
[0037]結(jié)果與分析 [0038] 1.最佳提取液的確定
[0039] 分別配制二甲基甲硫胺濃度為2%、4%、6%、8%、10%的并含有10%乙酸乙酯的 1M Tri s-HCl (pH7.5)溶液，配制方法為在1 OOmL的容量瓶中，加入10g乙酸乙酯，以及2、或4、 或6、或8、或10g的二甲基甲硫胺，然后加入已經(jīng)配好的1M Tris-HCl(pH7.5)并定容，得到二 甲基甲硫胺濃度為2% (或4%、或6%、或8%、或10%)的并含有10%乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液。按照上述RNA提取方法2進(jìn)行提取，并使用分光光度計測量A260和A280的 值，計算A260/A280比值，Rneasy Mini kit提取RNA作為陽性對照，其結(jié)果見表2。
[0040] 表2不同方法得到的RNA溶液的A260/A280比值
[0041]
[0042] 因此，本實施例中均使用二甲基甲硫胺濃度為6 %并含有10 %乙酸乙酯的1M Tr i s-HCl (pH7.5)溶液提取樣品RNA，但這并不限定于該濃度，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，其 它濃度的溶液所提取到的RNA同樣可以用于本發(fā)明的檢測，并取得同樣檢測效果。
[0043] 2.最佳反應(yīng)溫度的確定
[0044]以RNA提取方法2得到的總RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，實時濁度儀輸出的擴增 時間曲線結(jié)果如圖1。由圖中曲線可以看出，RT-LAMP在59、61、63和65°C的反應(yīng)溫度下，分別 在約46、44、42和38min時產(chǎn)生了擴增曲線。根據(jù)現(xiàn)場檢測時間盡可能短的要求，確定65 °C為 最佳反應(yīng)溫度。
[0045] 3. RT-LAMP特異性實驗
[0046] 黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草脈帶花葉病毒 (TVBMV)陽性材料及健康黃瓜葉片（陰性對照，用NC表示)為臨沂大學(xué)生物試驗中心保存的 標(biāo)本，從-30 °C冰箱中取出這些標(biāo)本，直接用鑷子取出約0.1 g葉片，按照本發(fā)明的RNA提取方 法2得到總RNA。以總RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，溫度為65 °C，時間為60min。體系中加入鈣 黃綠素?zé)晒馊玖弦允沟梅磻?yīng)結(jié)束后可以通過反應(yīng)管內(nèi)所產(chǎn)生的顏色變化判斷是否擴增，結(jié) 果如圖2所示。由圖2可以看出，只有CMV能夠檢測到擴增曲線，其他樣品在反應(yīng)時間內(nèi)都未 檢測到擴增曲線。反應(yīng)結(jié)束后，加入CMV總RNA的反應(yīng)管顯綠色，判斷為陽性;而其他反應(yīng)管 均顯橙色，判斷為陰性，結(jié)果如圖3所示。擴增曲線結(jié)果與顏色反應(yīng)的結(jié)果一致，表明本研究 所建立的RT-LAMP檢測方法具有高度的特異性，檢測結(jié)果十分準(zhǔn)確。
[0047] 本發(fā)明在建立CMV的RT-LAMP檢測方法過程中，采用了日本Eiken Chemical公司研 發(fā)配制的LoopampRNA擴增試劑盒，簡化了實驗反應(yīng)前的準(zhǔn)備工作，同時保證了實驗的質(zhì)量。 在結(jié)果分析方面，研究使用了LA-320C實時濁度儀，可對實驗結(jié)果定量分析。另外，通過在 RT-LAMP反應(yīng)體系中加入試劑盒配套的鈣黃綠素?zé)晒馊玖希沟貌婚_蓋也可觀察到反應(yīng)所 產(chǎn)生的顏色變化，避免了二次污染，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，使用本發(fā)明的RNA快速提取 液，可以在現(xiàn)場快速檢測，并現(xiàn)場得到結(jié)果，而不需要進(jìn)入實驗室使用Rneasy Mini kit提 取RNA。本發(fā)明的RNA快速提取液為二甲基甲硫胺濃度為6 %并含有10 %乙酸乙酯的1M Tr i s-HCl (pH7.5)溶液，雖然在本發(fā)明中能夠快速提取CMV病毒RNA的機理還不明確，但是根 據(jù)分析，由于其具有高極性，能夠使CMV病毒RNA快速釋放，并在RNA分解前加入到RT-LAMP反 應(yīng)體系，從而能夠順利作為模板，進(jìn)行RT-LAMP擴增。該機理將在今后的試驗中作進(jìn)一步的 闡明。
[0048]在建立針對某種病毒LAMP檢測方法時，最重要的是特異引物的設(shè)計，而引物是否 特異決定于所選序列的比對結(jié)果是否特異。因此，一定要在引物設(shè)計的前期做好充足的準(zhǔn) 備工作，利用序列分析軟件將目的序列篩選好，然后將序列進(jìn)行手動處理后再上傳至引物 設(shè)計服務(wù)器設(shè)計引物，才能夠得到較為理想的引物組。在進(jìn)行結(jié)果檢測方面，若有條件盡量 使用實時濁度儀，可以對結(jié)果進(jìn)行定量分析，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性;同時，在進(jìn)行結(jié)果檢測時， 一定盡量避免開蓋檢測，防止產(chǎn)生二次污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。
【主權(quán)項】
1. 一種黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物為： 上游外引物FIP序列SEQ ID N0.3; 上游內(nèi)引物BIP序列SEQ ID N0.4; 下游外引物F3序列SEQ ID NO. 1; 下游外引物B3序列SEQ ID NO.2; 以及環(huán)引物L(fēng)B序列SEQ ID NO.5。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，還包括黃瓜花葉病毒的RNA的快速提取液， 所述快速提取液由1 〇 %的乙酸乙酯、2~10 %的二甲基甲硫胺和1M Tr i s-HClpH7.5構(gòu) 成。3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，所述二甲基甲硫胺的濃度為6%。4. 一種黃瓜花葉病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 S1使用由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成的快速 提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板； S2使用如權(quán)利要求1所述試劑盒，構(gòu)建RT-LAMP反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系為20yL，包括:2 X反應(yīng)緩沖液10yL，酶溶液0.8yL，40pmo 1/yL上游引物FIP 0.8yL，40pmo 1 AxL上游引物 BIP0 · 8yL，1 Opmo 1 /yL下游引物F3 0 · 4yL，1 Opmo 1 /VL下游引物B3 0 · 4yL，20pmo 1 /VL環(huán)引物 LBO. 8yL，RNA 模板 1.6yL，及去離子水4.4yL; S3將所述RT-LAMP反應(yīng)體系，置于65 °C水域中，反應(yīng)60分鐘，得到反應(yīng)液； S4對所述反應(yīng)液進(jìn)行檢測。5. 如權(quán)利要求4所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述二甲基甲硫胺的濃度為6 %。6. 如權(quán)利要求4所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述S4步驟中是在所述反應(yīng)液中加入 加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，通過反應(yīng)管內(nèi)所產(chǎn)生的顏色變化判斷檢測結(jié)果。
【文檔編號】C12Q1/70GK105969911SQ201610497704
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】王瑩
【申請人】臨沂大學(xué)