嘧啶衍生物、細(xì)胞毒性劑、藥物組合物及其應(yīng)用
【專利摘要】一種式(Ⅰ)所示的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽，其中，R1、R2、R0如說明書所述，其用于制備細(xì)胞毒性劑以及抗腫瘤藥物。
【專利說明】嘧啶衍生物、細(xì)胞毒性劑、藥物組合物及其應(yīng)用
[0001] PI3K/Akt/mT0R信號通路是細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中非常重要的一條通路，它對細(xì)胞 的很多重要生理功能都有調(diào)控作用，比如細(xì)胞生長、增殖、分化、迀移、存活、血管生成、葡萄 糖代謝以及細(xì)胞膜的波動等 [1'2]。
[0002] PI3K激酶是一個(gè)復(fù)雜的脂酶家族，包括IA型、IB型、II型、III型和IV型（PI3K 相關(guān)激酶）。IA型PI3k由受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK)激活，包 括一個(gè)調(diào)節(jié)亞基P85和一個(gè)催化亞基pllO,根據(jù)催化亞基的不同IA型PI3k分為pllO a、 0和S三個(gè)亞型。IB型PI3k只有一個(gè)pllOy亞型，它包括一個(gè)a pllOy催化亞基和 一個(gè)plOl的調(diào)節(jié)亞基組成，通過G-蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor)激活。 I型PI3K能夠催化磷酸化4, 5-磷脂酰肌醇二磷酸鹽（phosphatidylinositol (4, 5)-bisp 11〇8口1^七6，？1?2)3位的羥基生成一個(gè)信號分子3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸鹽&11〇8口1^1:1(17 linositol (3, 4, 5)-trisphosphate，PIP3)，PIP3 能夠激活下游的 H3K1 和 Akt 激酶實(shí)現(xiàn)信 號的傳導(dǎo)。在細(xì)胞內(nèi) PIP3 的濃度還受 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的調(diào)控，PTEN的作用是詰抗PI3K對下游通路的激活，它最重要的功能 是在磷酸肌醇的3位上起到去磷酸化的作用，使PI3K產(chǎn)生的信號分子PIP3去磷酸化變回 PIP3 從而反向調(diào)節(jié) PI3K 信號[1'3'4]。II 型 PI3K 包括 PI3K-C2a、PI3K-C2 0 和 PI3K-C2y 三個(gè)亞型，它能夠磷酸化磷脂酰肌醇和4-磷脂酰肌醇磷酸鹽但是不能磷酸化4, 5-磷脂酰 肌醇二磷酸鹽（PIP2)[5]。III型PI3K只有一個(gè)成員Vps34,它只能磷酸化磷脂酰肌醇生成 3_磷脂酰肌醇磷酸鹽，在的功能與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬有關(guān) [6]。IV型PI3K包含和其他PI3K 激酶相似的催化區(qū)域，其成員包括mTOR、ATR、ATM、DNA-PK[ 4'7]。
[0003] PI3K信號通路的失調(diào)或者異常活躍與許多疾病的發(fā)生都有密切的關(guān)聯(lián)。在多種 腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了由于突變導(dǎo)致的PllO a過度表達(dá)，在超過30%的實(shí)體瘤中都發(fā)現(xiàn)了編碼 pll〇a的PIK3CA基因的突變m，在40%卵巢癌和50%的宮頸癌中發(fā)現(xiàn)了 PIK3CA的突變 ^PllOS和y是白細(xì)胞信號系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，通過抑制它們的活性能夠治療炎癥和自免 疫相關(guān)的疾病 [9]。有證據(jù)顯示P11O0在PTEN缺失導(dǎo)致的腫瘤生成中起著關(guān)鍵的作用，在 體內(nèi)和體外下調(diào)編碼pll〇 0的PIK3CB基因的表達(dá)能抑制PI3K的信號并抑制腫瘤的生長 [1°]。近些年來，隨著人們對PI3K結(jié)構(gòu)功能研究的深入，PI3K在眾多疾病中的作用也越來越 清楚，PI3K已經(jīng)成為非常有前景的藥物靶點(diǎn)。因此，開發(fā)以PI3K為靶點(diǎn)的抑制劑成為藥物 化學(xué)界研究的熱點(diǎn)并且已經(jīng)有大量的PI3K抑制劑被報(bào)道出來，已經(jīng)有不少化合物處于臨 床研究階段。目前，已經(jīng)報(bào)道的PI3K抑制劑主要分為以下幾類：
[0004] 一、非選擇性的I型PI3K抑制劑
[0005] LY294002and wortmannin (結(jié)構(gòu)如式一）是最早的一代非選擇性的I型PI3K抑制 劑，它們都抑制pll〇催化亞基。LY294002是禮來公司開發(fā)的一類可逆的ATP競爭性的抑制 劑，它不但能抑制I型PI3K還能抑制mTOR及DNA-PK。Wortmannin是從真菌中分離出來的 天然產(chǎn)物，它通過和pll〇a的Lys802殘基和pllOy的Lys833殘基產(chǎn)生共價(jià)作用而發(fā)揮 作用。由于它們的毒副作用、差的藥理學(xué)性質(zhì)和缺乏選擇性并沒有進(jìn)一步的臨床開發(fā) [11'12]。 [0006] XL147 (結(jié)構(gòu)如式一）是新一代的I型PI3K抑制劑，它對pllO a、S和y抑 制活性分別為IC50 = 39、383、23和36nM并且對VPS34、DNA-PK和mTOR沒有抑制活性。在 體外腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)中，XL147能夠抑制腫瘤細(xì)胞的PI3K信號傳導(dǎo)，在臨床前的乳腺癌、 肺癌、卵巢癌、前列腺癌體內(nèi)模型中，它能引起腫瘤生長減緩和收縮。XL147已經(jīng)進(jìn)入臨床試 驗(yàn)階段，在臨床階段將評價(jià)其單獨(dú)用藥或者聯(lián)合用藥對實(shí)體瘤、淋巴瘤和轉(zhuǎn)移的乳腺癌等 多種腫瘤的安全性和有效性 [1]。
[0007] DGC-0941 (結(jié)構(gòu)如式一）是一類口服有效的I型PI3K抑制劑，對pllO a、0、S 和Y抑制活性分別為IC50 = 3、33、3和75nM并且在細(xì)胞中測試抑制AKT磷酸化的試驗(yàn)中 IC50 = 28nm[11]。⑶C-0941 能以較低的 IC50 值抑制 U87MG、PC3、SK0V-3、IGR0V-l、Detroit 562、HCT116、SNUC2B和LoVo細(xì)胞系。⑶C-0941在無胸腺小鼠U87MG和IGR0V-1移植模型 中也有很好的作用。目前，⑶C-0941也處于臨床研究階段 [13]。
[0008] BKM120 (結(jié)構(gòu)如式一）是一種有效的I型PI3K抑制劑，對pllO a、0S和y抑 制活性分別為IC50 = 52、166、116和26InM，它對III型和IV型PI3K表現(xiàn)出了較低的抑制 活性，對mTO R和其他蛋白激酶比如HERUJAK2和TOK1至少有50倍的選擇性。BKM120在 細(xì)胞和腫瘤移植模型中都能夠有效降低AKT的磷酸化水平，它還能抑制BCR和細(xì)胞趨化性， 增加慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對苯達(dá)莫司汀和磷酸氟達(dá)拉濱的敏感性并且對正常淋巴細(xì)胞 的毒性小 [14]。目前，BKM120治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、與INC424合用 治療骨髓纖維化、與利妥昔單抗合用治療B細(xì)胞淋巴瘤都處在一期臨床試驗(yàn)階段（http:// www. clinicaltrials. gov/)〇
[0009] 二、選擇性PI3K抑制劑
[0010] CAL-101 (Idelalisib)(結(jié)構(gòu)如式一）是吉利德公司開發(fā)的一類plio 5選擇性抑 制劑，對pll〇a、0、S和y抑制活性分別為IC50 = 820、565、89和2. 5nM，其pll〇a對 于其它亞型的選擇性在40-300倍之間。它對很多惡性血液疾病比如復(fù)發(fā)的或者難治愈的 慢性粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤在臨床上都有 很好的效果 [1]。2014年7月23日，美國FDA批準(zhǔn)了吉利德研發(fā)的Idelalisib(商品名： Zydelig)上市，Idelalisib成為第一個(gè)上市的PI3K抑制劑。FDA批準(zhǔn)了 Idelalisib的三 個(gè)適應(yīng)癥：和利妥昔單抗（Rituxan)聯(lián)合治療復(fù)發(fā)的慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL)、作為單藥 治療復(fù)發(fā)性濾泡B細(xì)胞、非霍奇金淋巴瘤（FL)和復(fù)發(fā)性小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（SLL)。
[0011] AS-252424(結(jié)構(gòu)如式一）是一類pllOy選擇性抑制劑，它表現(xiàn)出對pllOy以外 其它I型PI3K亞型超過300倍的選擇性，對pllO a、0S和y抑制活性分別為IC50 = 935、20000、2000和33nM。它對絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶抑制活性低（IC50>10 yM，分 別為78和79 y M)。盡管AS-252424在大鼠中有比較高的清除率（2. 3L/kg*h)和比較短的 口服半衰期（t1/2= lh)，但是在硫膠質(zhì)引起的腹膜炎小鼠模型中口服給藥10mg/kg劑量就 能減少35%的嗜中性粒細(xì)胞的聚集[3]。
[0012] PIK_75(結(jié)構(gòu)如式一）是一個(gè)pll〇a選擇性抑制劑，對pll〇a抑制活性為IC50 =0? 3nm,對其它PI3K亞型亞的選擇性在130 - 2800倍。在A373、HeLa、A549、MCF7和 MCF7ADR-res細(xì)胞系抗增殖試驗(yàn)中都表現(xiàn)出了低于微摩爾級的活性，并且在HeLa人宮頸癌 移植模型試驗(yàn)中也有效 [15]。
[0013] 丁61〇〇-115(結(jié)構(gòu)如式一）是一類選擇性的口11〇8和丫抑制劑，它對口11〇(1、0、 S和 y抑制活性分別為IC50 = 1300、1200、83和235nM。最顯著的是它的選擇性，它在 lyM濃度下對其它136種蛋白激酶的抑制率都在50%以下[3]。在血管內(nèi)皮生長因子和血 小板活化因子參與的心肌梗塞中表現(xiàn)出了很好的抑制水腫和炎癥的活性；在缺血性腦傷發(fā) 生后對組織存活有一個(gè)非常重要的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂過程，TG100-115對這個(gè)過程沒有 中斷作用；已經(jīng)有報(bào)道心肌梗賽動物模型中它在保護(hù)心臟和減小梗塞方面極其有效 [4]。
[0014] 三、Pm/mTOR雙重抑制劑
[0015] 咪唑喹唑啉類化合物NVP-BEZ235 (結(jié)構(gòu)如式一）是PI3K/mT0R雙重抑制劑，它對 pllO a、0S和y以及mTOR抑制活性分別為IC50 = 4、75、7和5nM以及20. 7nm。這個(gè) 化合物能夠通過將細(xì)胞周期阻滯在G1期而有效地阻斷過于活躍的的PI3K信號，而且它有 很好的耐受性。另外，NVP-BEZ235也能抑制pllOa的致癌突變（E545K和H1047R)引起的 PI3K/mT0R通路的異常激活。它在和傳統(tǒng)的細(xì)胞毒劑多柔比星和長春新堿聯(lián)合用藥評價(jià)其 有效性實(shí)驗(yàn)中顯示出了非常有前景的效果，它用于治療高級實(shí)體瘤和乳腺癌已經(jīng)處在臨床 評價(jià)階段 [1]。
[0016] XL-765(結(jié)構(gòu)如式一）是一個(gè)活性在低納摩爾水平上的PI3K/mT0R雙重抑制劑，它 對pllOa、0S和 y以及mTOR抑制活性分別為IC50 = 39、113、9和43nM以及157nm。 在最近的研究中發(fā)現(xiàn)XL-765和誘導(dǎo)自噬藥物聯(lián)合用藥能夠增加其在胰腺癌中的抗腫瘤活 性。XL-765和化療藥物合用已經(jīng)在臨床試驗(yàn)階段，數(shù)據(jù)顯示病人的終末半衰期在2-15小時(shí) 之間存在病人間差異性 [13]。在小鼠的前列腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等多種人癌細(xì)胞移 植模型中都觀察到了腫瘤生長的停止或者收縮。在單獨(dú)用藥治療實(shí)體瘤的臨床一期實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)顯示，在83名病人中有12名病人病情穩(wěn)定16周或者更多；7名病人病情穩(wěn)定24周或者 更多。其觀察到最頻繁的的毒副作用是肝臟酶活性增高、皮疹和胃腸道不適 [16]。
[0017] ⑶C-0980 (結(jié)構(gòu)如式一）是嗎啡啉衍生物其做為一種PI3K/mT0R雙重抑制劑正處 于二期臨床研究階段，它是通過取代GDC-0941上的吲唑環(huán)為2-氨基嘧啶合成而來的，這種 取代增加了 mTOR的抑制活性。GDC-0980對前列腺癌、乳腺癌和肺癌等多種癌細(xì)胞系都表 現(xiàn)出了很好的活性，但是它對黑色素瘤和胰腺癌活性比較低，這可能跟在這兩種腫瘤中是 以KRAS和BRAF耐藥標(biāo)記有關(guān)。它在PC3和MCF-7 neo/HER2細(xì)胞移植模型中都顯示出了 有效抑制作用[13]。
[0018] 惠氏發(fā)現(xiàn)了一系列三唑嘧啶類化合物，其中PKI_402(結(jié)構(gòu)如式一）是一個(gè) 口110<1/1111'01?的雙重抑制劑，對口110€[和1111'01?抑制活性分別為1050 = 1.411]\1和1.711]\1。在 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中PKI-402能夠引起細(xì)胞凋亡并且顯示了很高的抗增殖活性，在很多的腫瘤 移植模型中都有抗腫瘤效果 [1]。在MDA-MB-361細(xì)胞系中研究PKI-402產(chǎn)生抑制效果的機(jī) 制發(fā)現(xiàn)其能在體內(nèi)和體外抑制Akt Ser473和Thr308的磷酸化，也能抑制Akt下游祀分子 的磷酸化；PKI-402MDA-MB-361細(xì)胞系凋亡依賴caspase-3通道 [13]。
[0019] 輝瑞公開的PF-04691502 (結(jié)構(gòu)如式一）是一種pllO a /mTOR的雙重抑制劑其對 口110<1和1111'01?抑制活性分別為1050 = 0.5711]\1和1611]\1，在口110<1突變的31(0￥3卵巢癌體 內(nèi)移植模型實(shí)驗(yàn)中有很高的有效性，PF-04691502用于治療實(shí)體瘤已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段
[1] 〇 ?
[0020] 式一 PI3K抑制劑結(jié)構(gòu)
[0021]
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0040] 本發(fā)明的目的是提供嘧啶衍生物、PI3K抑制劑、藥物組合物及其在抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0042] 式（I )所示的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽，
[0043]
[0044] 其中，
[0045] &為氫，以C i+Ce為取代基的可選取代的芳基，可選取代的C i+Ce直鏈、支鏈或環(huán) 狀烷基，酰二胺基，以鹵素、以可選取代的仏一(：6直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基為取代基的芳基，以 可選取代的仏一(：6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基為取代基的吡啶基，以可選取代的C 直鏈、 支鏈、或環(huán)狀烷基為取代基的砜基，以可選取代的(^一(:6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的 磺酰基，以可選取代的(^一(:6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、吡啶基、鹵代苯基、胺基、腈基、鹵代烷 基為取代基的羰基，可選取代的(^一(: 6直鏈、支鏈或環(huán)狀醇基，酯基，醚基或羧基；
[0046] R2為氫，
NHR2' 或 NHC0NHR3;
[0047] 其中，所述&。為H或可選取代的C 直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；所述R 2'為H或 以(；一(：6直鏈、支鏈烷基、C 3-(：6環(huán)烷基為取代基的可選取代的酰胺基，以可選取代的C :一 C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的三取代胺基，以一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)鹵原子為取代基的 可選取代的(；一(： 6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，C 直鏈或支鏈烷氧基，可選取代的C 1一(：6直 鏈、支鏈或環(huán)狀醇基，哌嗪基吡啶基，胺基吡啶基，哌嗪基芳基或鹵素為取代基的芳基；其中 哌嗪基和胺基為以可選取代的(^一(：6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的取代哌嗪基和取代 胺基；所述R 3 =可選取代的C 直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基以及可選取代的芳基；
[0048] R。為氫、羥基或可選取代的C1 一C6直鏈、支鏈或環(huán)狀醇基。
[0049] 本發(fā)明中，式（I)所示的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽， 其中，
[0050] (1)當(dāng)& =可選取代的芳基，R2= H時(shí)，RQ = -OH或RQ'0H，其中，R。'為可選取代 的(；一(：6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0051] 當(dāng)札=可選取代的芳基，R〇= H時(shí)：
或NHR2'，其中，Ri。為H或可選取 代的(；一(：6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基；R2' = H或C0NHR3;其中，R3= H，C 直鏈、支鏈烷 基，環(huán)烷基，以C 直鏈或支鏈烷基為取代基的三取代胺基，一鹵代C 直鏈、 支鏈或環(huán)狀烷基，二鹵代(；一(：6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、三鹵代C 直鏈、支鏈或環(huán)狀烷 基，
H8，R90H 或

[0052] 其中，
[0053] 當(dāng)X = N時(shí)，所述R4= 或NHR6,其中，R 5、R6獨(dú)立地為C廠(：6直鏈或支鏈 烷基；
[0054] 當(dāng) x = C 時(shí)，所述 R4=H 、鹵素，其中，R7 = H、Ci-C6烷基、B0C 或-
[0055] 所述Rs為可選取代的C「C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0056] 所述R9為可選取代的C「C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0057] (2)當(dāng) R〇= H，R := NHC0NHR/ 時(shí)，R2= CONHR n，所述 R3'、Rn各自獨(dú)立地為 H、可 選取代的(；一(：6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基；
[0058] (3)當(dāng)RQ= H，R H或C :―C6直鏈、支鏈烷基時(shí)；R 2= NHC0NHR 3, R3為可選取代 的(；一(：6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0059] (4)當(dāng)私=札1?2=見10)見^3，且1?3為可選取代的(： 1一(：6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基時(shí)，
[0060] 其中，
[0061] 所述Rn、R2。、R21各自獨(dú)立地為H或可選取代的C 直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0062] 所述 Rl2、Rl3、Rl4a、尺16、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、尺29、尺3。、尺31、尺32、尺33、尺34、各自獨(dú)^?地 為可選取代的(；一(： 6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；
[0063] 所述R14為可選取代的C 直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或三鹵代C 直鏈、支鏈、 或環(huán)狀烷基；
[0064] 所述R15為可選取代的C 直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基或以鹵素或C 直鏈、支鏈 或環(huán)狀烷基為取代基的可選取代的芳烴；
[0065] 所述R1S、R19獨(dú)立地為H、Boc或可選取代的C「C 6直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基；
[0066] 所述 Y = F、Cl、Br 或 I ;
[0067] 所述 Z 為 F、Cl、Br、I 或氫；
[0068] 本發(fā)明中，嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽，其中，
[0069] (1)當(dāng)R1 =芐基，R2= H時(shí)，R。為羥基、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇； S
[0070] 當(dāng)札=芐基，R〇= H 時(shí)，r2= -A-NHR|。，NHR2' 或 NHC0NHR3;
[0071] 其中，
[0072] 所述&。為H、甲基、乙基、丙基或丁基；
[0073] 所述 R2' = H 或 C0NHR3;
[0074] 所述R3= H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、環(huán)丙烷基、二甲基乙基胺、氟代乙基、 二氣代乙基、二氣代乙基、一_〇 _馬或R9OH;
[0075] 其中，當(dāng)X = N時(shí)，所述R4= H、-%或NHR6，其中，R5、R6獨(dú)立地為甲基、乙基、 丙基或丁基；
[0076] 當(dāng) X = C 時(shí)，所述 R4= H、或 F，其中，R7 = H、B0C 或-?〇;
[0077] 所述R8為甲基、乙基、丙基或丁基；
[0078] 所述R9為甲基、乙基、丙基或丁基；
[0079] (2)當(dāng) RQ= H 時(shí)，Ri= NHCONHR/ ;R2= C0NHRn，所述 R3'、Rn各自獨(dú)立地為甲基， 乙基、丙基、異丙基或丁基；
[0080] (3)當(dāng)Rc= H時(shí)，R1= H、甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基時(shí)；R2= NHC0NHR3，R3 = 甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基；
[0081] (4)當(dāng)RQ= H，R2= NHC0NHR3，R3=甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基時(shí)，R1 =
[0082] 所述R1Q、Rn、R2。、R 21各自獨(dú)立地為H或甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基；
[0083] 所述 R12、Rl3、Rl6、Rl8a、R23、R24、R26、R27、R28、R29、R3。、R3I、R32、R33、R34各自獨(dú)立地為甲 基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；
[0084] 所述R14為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、一氟代(^-(：4直鏈或支鏈烷基、二氟代 (；-(： 4直鏈或支鏈烷基、三氟代甲基、三氟代乙基、三氟代丙基、三氟代異丙基、三氟代丁基或 三氟代異丁基；
[0085] 所述R15為甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，一氟代C「(： 4直 鏈、支鏈、環(huán)狀烷基，二氟代Q-Q直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基，三氟代c i-c4直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基， 以氟或(^一匕直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基為取代基在對位、鄰位、間位取代或未取代的苯基；
[0086] 所述R1S、R19獨(dú)立地為H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基或Boc ;
[0087] 所述 Y = F ;
[0088] 所述 Z = F。
[0089] 本發(fā)明所述的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽，為以下化合 物之一：
[0090]

[0092] 本發(fā)明所述的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽的制備方法， 由化合物1制備而成，所述化合物1的制備方法為：
[0093]
[0094] 本發(fā)明的細(xì)胞毒性劑，包含所述的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接 受的鹽。
[0095] 本發(fā)明的藥物組合物，包含治療有效量的所述的的嘧啶衍生物及其多種晶型體或 其藥學(xué)上可以接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0096] 本發(fā)明所述的嘧啶衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可以接受的鹽在制備細(xì)胞 毒性劑以及抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0097] 本發(fā)明所述的細(xì)胞毒性劑在制備針對PI3K激酶異常改變的藥物以及抗腫瘤藥物 中的應(yīng)用。
[0098] 本發(fā)明所述的藥物組合物在制備制備針對PI3K激酶異常改變的藥物以及抗腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
[0099] 本發(fā)明中，化合物1的合成路線如下：
[0100]
[0101] 利用化合物1合成脲衍生物包括以下兩個(gè)步驟：
[0102]
[0103] 其中脲的合成通法如下：
[0104] 將 GL-1 (94mg，0. 2mmol)溶解在 2mL 無水 DCM 中并加入三乙胺（61mg，0. 6mmol)。 混合物在冰鹽浴下冷卻，加入三光氣（30mg，0. lmmol)，繼續(xù)在冰鹽浴下攪拌15min后，5eq 胺的無水DCM溶液或者胺的鹽酸鹽和6eq的三乙胺加入到上述反應(yīng)液中繼續(xù)反應(yīng)過夜。反 應(yīng)中加入水并用DCM萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，減壓蒸干溶劑，殘余物通過柱層 析或者制備薄層色譜純化得到相應(yīng)的脲衍生物。
[0105] 哌啶衍生物的合成路線如下：
[0106]
[0107] 利用GL-26制取哌啶衍生物的方式包括如下兩種：
[0108] 過程 A
[0109] 將GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在二氯甲烷中加入1.2eq HATU、相應(yīng)的酸 (1. leq)和4eq三乙胺，室溫下攪拌過夜后，加入飽和碳酸氫鈉，DCM萃取。有機(jī)相水和飽和 氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物通過柱層析純化得相應(yīng)的哌啶衍生物。
[0110] 過程 B
[0111] 將GL-26 (100mg，0. 15mmol)懸浮在無水二氯甲燒中加入3. 6eq三乙胺，冰浴下冷 卻至〇°C。然后，將1. leq酸酐或者酰氯的無水二氯甲烷溶液滴加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反 應(yīng)過夜或者TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，加入飽和碳酸氫鈉，二氯甲烷萃取，有機(jī)相用水和飽和氯 化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物通過柱層析純化得相應(yīng)的哌啶衍生物。
【附圖說明】 圖1為試驗(yàn)實(shí)施例64的實(shí)驗(yàn)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0112] 實(shí)施例1
[0113] 化合物3-(1-芐基哌啶-4-基）-5-氯-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶（化 合物1)的合成：
[0114] 第一步：
[0115]
[0116] 將N-Boc-4-哌啶甲酸（230mg，lmmol)和CDI (292mg，1. 8mmol)混合于三口瓶中，用 N2排空空氣然后加入2mL無水THF，反應(yīng)液在環(huán)境溫度下攪拌1-2h后將硝基甲烷（183mg， 3mmol)加到反應(yīng)體系中再加入DBU(685mg，4. 5mmol)。反應(yīng)液繼續(xù)攪拌36h后加入乙酸乙 酯稀釋，再加入6mL 2N HC1溶液，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水洗至中性，再用飽和氯化鈉 溶液洗三次，無水硫酸鈉干燥，減壓除去乙酸乙酯得到黃白色產(chǎn)物（130mg，收率96% )，不 用純化直接投下一步。mp 95-97°C ? 4 NMR(300MHz, CDC13) S 5. 36(s, 2H), 4. 14(d, J = 13 .8Hz, 2H), 2. 86-2. 76 (m, 2H), 2. 64 (tt, J = 11. 4, 3. 9Hz, 1H), 1. 90 - 1. 85 (m, 2H), 1. 68 -1. 55 (m, 2H), 1. 47 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 172. 94 [M-Boc+H]+.
[0117] 第二步：
[0118]
[0119] 將化合物 1-1 (452mg，1. 66mmol)和鹽酸輕胺（116mg，1. 67mmol)以及 NaHC03(140mg，1. 67mmol)混合并加入8mL乙醇，所得的懸濁液在50°C下反應(yīng)過夜。TLC監(jiān) 測反應(yīng)完成，減壓濃縮反應(yīng)液然后加入水和乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉溶液 分別洗三次然后用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得黃白色產(chǎn)物l-2(454mg，cis/trans = 6/1，收率 95%)，產(chǎn)物不用純化可直接投下一步。mp 147-149°C/H NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 11. 62 (s, 0. 11H), 11. 48 (s, 0. 71H), 5. 35 (s, 0. 3H), 5. 33 (s, 1. 7H), 3. 97 (d, J = 12. 9Hz, 2 H), 2. 93-2. 59 (m, 2H), 2. 46 (tt, J = 11.7,3. 6Hz, 1H), L 80-1. 760 (m, 1. 75H), 1. 63-1. 60 (m ,0. 34H), 1. 40 (s, 9H), 1. 40-1. 29 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 187. 96 [M-Boc+H]+.
[0120] 第三步：
[0121]
[0122] 將上步所得化合物1-2 (8. 912g，31mmol)溶解在80mL無水乙醚中，緩慢 滴加草酰氯單乙酯（3. 966mL，36mmol)的無水乙醚溶液，然后反應(yīng)混合物在室溫下 攪拌24h，反應(yīng)液降溫，在0 °C下滴加三乙胺（3. 923g，38. 8mmol)。滴完，混合物在 室溫下攪拌60h后減壓濃縮，加入水和乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉各 洗三次，然后用無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮柱層析得到白色產(chǎn)物1-3(6. 614g，收率 58 % )。mp 59-61。(： ? 4 NMR(300MHz，CDC13) S 4. 52 (q，J = 7. 2Hz，2H)，4. 21 (d，J = 13. 2Hz, 2H), 3. 27 (tt, J = 11.7,3. 6Hz, 1H), 2. 93-2. 85 (m, 2H), 2. 03 - 1. 98 (m, 2H), L 86 -1. 72 (m, 2H), 1. 47 (s, 9H), 1. 43 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 270. 05 [M-Boc+H]+.
[0123] 第四步：
[0124]
[0125] 將上步所制化合物l_3(151mg，0. 41mmol)溶于lmL氨的甲醇溶液并在室溫下 攪拌3h。減壓蒸干溶劑，殘余物用甲醇帶2次得到白色產(chǎn)物l-4(134mg，收率96 % )。 mp 184-186 °C ? 4 匪R(300MHz，DMS0-d6) S 8. 70(s，1H)，8. 57(s，1H)，4. 02(d，J = 12. 9Hz, 2H), 3. 38 (tt, J = 11. 7, 3. 3Hz, 1H), 2. 95-2. 86 (m, 2H), 2. 01-1. 96 (m, 2H), 1. 62 - I. 49(m, 2H), 1.41(s, 9H).ESI-MS:m/z = 241. 04[M-Boc+H]+.
[0126] 第五步：
[0127]
[0128] 將上步所制化合物l-4(85mg，0. 25mmol)溶于0. 5mL DCM中，加入1. 5mL TFA并在 室溫下攪拌2 h。減壓蒸干溶劑，殘余物用乙醇帶兩次以除去殘余TFA，得到淡黃色針狀晶 體 l-5(89mg，收率 100%)。mp NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.77(brs，2H)，8.7 4(s，1H)，8.61 (s，1H)，3.55 (tt，J = 11.4,3.3Hz，1H)，3. 41-3. 37 (m，2H)，3. 14-3. 07 (m，2H) ,2. 19-2. 14 (m, 2H), 1. 97-1. 83 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 241. 04[M+H]+.
[0129] 第六步：
[0130]
[0131] 將上步所制化合物1-5 (604mg，1. 71mmol)懸浮在乙腈中加入2eq三乙胺在室溫 下攪拌2h進(jìn)行解離。乙腈減壓蒸干殘余物用乙腈帶兩次以除去殘余三乙胺。殘余物加入 5mL無水乙腈和DIPEA(441mg，3. 41mmol)并且降溫至0°C，緩慢滴加溴芐（292mg，1. 71mmol) 的無水乙腈溶液。滴完在室溫下攪拌反應(yīng)，TLC和LC-MS監(jiān)測反應(yīng)完成后減壓濃縮，然后 加入氯仿和飽和碳酸鈉溶液，氯仿萃取。有機(jī)相柱層析純化得到淡黃色固體1-6 (456mg， 收率81%)。11^ 134-136。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.70(8，111)，8.57(8，111)，7.36-7.22(m,5H),3.52(s,2H),3. 16(tt,J = 11.4, 3. 3Hz, 1H) , 2. 91 (d, J = II. 7Hz, 2H), 2. 09 (t, J = 11. 7Hz, 2H), 1. 99-1. 95 (m, 2H), 1. 79-1. 65 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 331. 08[M+H]+.
[0132] 第七步：
[0133]
[0134] 將上步所制化合物1-6 (73mg，0? 22mmol)懸浮在2mL混合溶劑（乙醇：水 =2:1)中并且冷卻至0°C。然后加入氯化銨（296mg，5. 53mmol)，分批緩慢加入鋅 粉（145mg，2. 22mmol)，室溫下攪拌4h。抽濾除去不溶物，濾液蒸干柱層析純化得 至丨J 淡黃色固體 l_7(52mg，收率 78 % )。mp 189-191 °C "H NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 7. 69 (s, 2H), 7. 36 (s, 1H), 7. 36 - 7. 21 (m, 5H), 5. 16 (s, 2H), 3. 50 (s, 2H), 2. 89-2. 65 (m, 2H ),2. 75(tt, J = 11.7, 3. 6Hz, 1H), 2. 10-2. 01 (m, 2H), 1. 92-1. 87 (m, 2H), 1. 72-1. 58 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 301. 08[M+H]+.
[0135] 第八步：
[0136]
[0137] 將上步所制化合物1-7 (60mg，0. 2mmol)溶解在2mL無水THF中，加入三光 氣（30mg，0. lmmol)，升溫回流lh。反應(yīng)混合物降溫至室溫，抽濾收集白色沉淀物并 用乙酸乙酯或者DCM洗滌得目標(biāo)化合物1-8 (66mg，收率90 % )。mp 142-144 °C . 4 NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 11. 67 (s, 2H), 11. 61 (s, 1H), 10. 99 (s, 1H), 7. 67-7. 64 (m, 2H), 7. 49 - 7. 47 (m, 3H), 4. 35 (d, J = 3. 9Hz, 2H), 3. 46 (d, J = 11. 7Hz, 2H), 3. 23-3. 12 (m, 1H )，3. 03-2. 92 (m, 2H)，2. 30-2. 04 (m, 4H) ? ESI-MS: m/z = 327. 11 [M+H]+.
[0138] 第九步：
[0139]
[0140] 將上步所得化合物l-8(236mg，0. 62mmol)和6mL三氯氧磷的混合物升溫回流反 應(yīng)24h，然后減壓濃縮至干，殘余物倒到碎冰中淬滅。水相用6N NaOH水溶液調(diào)pH = 8-9， 加入乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用水洗至中性，飽和氯化鈉洗三次，無水硫酸鈉干燥然后減 壓蒸干溶劑，殘余物溶解在8mL DCM中并用冰鹽浴降溫，然后加入TEA(90mg，0. 89mmol)。 將嗎啡啉（55mg，0. 63mmol)的DCM溶液滴加到上述溶液中并繼續(xù)攪拌lOmin。TLC反應(yīng) 完全后加入水，然后用DCM萃取有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，蒸干溶劑柱層析得到淡 黃色固體化合物 l(167mg，收率62%)。11^ 168-170°(：.111匪1?(30011抱，0)(：13)57.37-7. 23 (m, 5H), 4. 21 - 3. 95 (m, 4H), 3. 84 (t, J = 5. 1Hz, 4H), 3. 57 (s, 2H), 3. 17-3. 07 (m, 1H), 3 .02-2. 98 (m, 2H), 2. 23 - 1. 98 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 414. 18 [M+H]+.
[0141] 實(shí)施例2
[0142] 利用化合物1通過Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)制備如下所示的啼啶衍生物4-(3-(1-芐基哌 啶-4-基）-7_嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯胺（GL-1):
[0143]
[0144] 將化合物1 (414mg，lmmol)、對氨基苯硼酸頻哪醇酯（329mg，1. 5mmol)、 Pd(Pcy3)2Cl2(37mg，0. 05mmol)和 CsF(456mg，3mmol)放在三 口瓶中，三 口瓶排空空氣再充 入Ar氣，重復(fù)進(jìn)行三次，然后將12mL溶劑（NMP:水=9:1)注射到三口瓶中。反應(yīng)混合 物在Ar氣保護(hù)下100°C下反應(yīng)48h后，加入水稀釋并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水和飽和 氯化鈉洗滌，減壓濃縮，殘余物通過柱層析得黃色固體化合物GL-1 (160mg，產(chǎn)率34% )。 mp 118-119 6. 70 (m，2H)，4. 14-4. 11 (m，4H)，3. 88 - 3. 85 (m，6H)，3. 63 (s，2H)，3. 30-3. 13 (m，1H)，3. 07-3 .03 (m, 2H), 2. 42-2. 09 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 471. 28[M+H]+.
[0145] 實(shí)施例3
[0146] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-2)
[0147]
[0148] 按上述反應(yīng)式，GL-2是用相應(yīng)胺的鹽酸鹽通過脲的合成通法合成的黃色固體 (52mg，收率 49 % )。mp 147-149 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 79 (s, 1H), 8. 23 (d, J =8. 7Hz, 2H), 7. 52(d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 25 (m, 5H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H) ,4. 05-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 17-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 92 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 528. 38 [M+H]+.
[0149] 實(shí)施例4
[0150] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-乙脲（GL-3)
[0151]
[0152] 按上述反應(yīng)式，GL-3是用相應(yīng)胺的鹽酸鹽通過脲的合成通法合成的黃色固體 (53mg，收率49% )。mpl40-14rC ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) S 8. 70 (s, 1H)，8. 24-8. 20 (m, 2H ),7. 52-7. 48 (m, 2H), 7. 35 - 7. 22 (m, 5H), 6. 17 (t, J = 5. 5Hz, 1H), 4. 05-4. 02 (m, 4H), 3. 80 - 3. 77 (m, 4H), 3. 53 (s, 2H), 3. 17-3. 08 (m, 3H), 2. 94-2. 90 (m, 2H), 2. 22-2. 09 (m, 4H), 2. 04-1. 90 (m, 2H), 1. 06 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 542. 39[M+H]+.
[0153] 實(shí)施例5
[0154] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-4)
[0155]
[0156] 按上述反應(yīng)式，GL-4是用氨的甲醇溶液通過脲的合成通法合成 的黃色固體（46mg，收率 50 % )。mp204-206 °C NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 80 (s, 1H) ,8.25 - 8. 22 (m, 2H), 7. 54-7. 50 (m, 2H) ,7.35 - 7. 23 (m, 5H), 5. 94 (s, 2H ),4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 23-2. 10(m, 4H), 2. 03- 1.91(m, 2H). ESI-MS:m/z = 514. 39[M+H]+.
[0157] 實(shí)施例6
[0158] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2-(二甲氨基）乙基）脲（GL-5)
[0159]
[0160] 按上述反應(yīng)式，GL-5是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的 黃色固體（70mg，收率 67 % )。mp 96-98 °C . 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 94 (s, 1H) , 8. 23 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 50 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 19 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2 H),3. 20(q, J = 6.0Hz,2H), 3. 15-3. 08 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 1Hz, 2H), 2. 36 (t, J =6. 0Hz, 2H), 2. 20 (s, 6H), 2. 20-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 585. 62[M+H]+.
[0161] 實(shí)施例7
[0162] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-異丙基脲（GL-6)
[0163]
[0164] 按上述反應(yīng)式，GL-6是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（41mg， 收率 37 % )。mp 205-206 °C ? 4 NMR (300MHz, DMS0-d6) 58.56 (s，lH), 8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 49 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 07 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 4. 06-4 .03(m, 4H), 3. 81-3. 74(m, 5H), 3. 54(s, 2H), 3. 14(tt, J = 11. 1, 4. 2Hz, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 22 - 2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H), 1. 11 (d, J = 6. 6Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 556. 38 [M+H]+.
[0165] 實(shí)施例8
[0166] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_環(huán)丙基脲（GL-7)
[0167]
[0168] 按上述反應(yīng)式，GL-7是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（46mg， 收率 42 % )。mp 220-221 °C ? 4 NMR (300MHz, DMS0-d6) 58.58 (s，lH), 8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 52 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 24 (m, 5H), 6. 45 (d, J = 2. 7Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 10. 5Hz, 2H), 2. 60-2. 53 (m, 1H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H), 0. 68 - 0. 62 (m, 2H), 0. 44 - 0. 39 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 554. 43 [M+H]+.
[0169] 實(shí)施例9
[0170] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2-氟乙基）脲（GL-8)
[0171]
[0172] 按上述反應(yīng)式，GL-8是用相應(yīng)胺的鹽酸鹽通過脲的合成通法合成的黃色固體 (47mg，收率 42 % )。mpll5-117°C "H NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.84(s，lH)，8.24(d，J = 9. 0Hz, 2H), 7. 52 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 45 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 56 (t, J =4. 8Hz, 1H), 4. 40 (t, J = 5. 1Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H),3. 47(q, J = 5. 4Hz, 1H), 3. 38 (q, J = 5. 4Hz, 1H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 1Hz, 2H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 92 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 560. 38 [M+H]+.
[0173] 實(shí)施例10
[0174] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(6-(4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-3-基）脲（GL-9)
[0175]
[0176] GL-9是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（43mg，收率30%)。 mp 144-145 °C ? 4 匪R (300MHz，DMS0-d6) 5 9.00 (s，lH)，8.54 (s，lH)，8. 30-8. 26 (m，2 H), 8. 16 (d, J = 3. 0Hz, 1H) ,7.71 (dd, J = 9. 0, 2. 7Hz, 1H), 7. 58-7. 53 (m, 2H), 7. 36 -7. 25 (m, 5H), 6. 83 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 79 (m, 4H), 3. 56 (s, 2H), 3. 43 - 3. 40 (m, 4H), 3. 20-3. 12 (m, 1H), 2. 97-2. 93 (m, 2H), 2. 48-2. 45 (m, 4H), 2. 26 (s, 3 H),2. 26-2. 12(m, 4H), 2. 05-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 689. 78[M+H]+.
[0177] 實(shí)施例11
[0178] 利用GL-1制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶_5_基）苯基）_3_ (4- ((2-(二甲胺基）乙基）（甲基）氨基）苯基）脈（GL-10)
[0179]
[0180] 將 #-(2-(二甲胺基）乙基甲基-1,4-苯二胺（116mg，0.6mmol)溶解 在4mL無水DCM中并加入三乙胺（182mg，1. 8mmol)，所得混合物冰鹽浴下冷卻。將三光 氣（89mg，0. 3mmol)的無水DCM溶液滴加到反應(yīng)液中并繼續(xù)在冰鹽浴下攪拌15min。然 后將GL-1 (94mg，0. 2mmol)的無水DCM溶液滴加到上述反應(yīng)液中并攪拌過夜后，加入水， DCM萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，減壓濃縮，殘余物通過柱層析和制備薄層色 譜純化得黃色固體 GL-10 (50mg，收率 36 % )。mp 134-135 °C ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) 8 8. 81 (s, 1H), 8. 33 (s, 1H), 8. 27 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 56 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 -7. 24 (m, 7H), 6. 66 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2 H), 3. 37 (t, J = 7. 2Hz, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 86 (s, 3H), 2. 38 ( t, J = 7. 2Hz, 2H),2, 23-2. ll(m, 4H),2. 20(s, 6H),2. 05 - 1.93 (m, 2H).ESI-MS:m/z = 690. 54 [M+H]+.
[0181] 實(shí)施例12
[0182] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(6-(甲氨基）吡啶-3-基）脲（GL-11)
[0183]
[0184] 按上述反應(yīng)式，GL-11是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的紅色固體（69mg，收 率 56% )。mpl49-15(TC ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 91 (s，1H)，8. 29-8. 25 (m，3H)，8. 00 (d ,J = 3. 0Hz, 1H), 7. 58 - 7. 50 (m, 3H), 7. 36 - 7. 25 (m, 5H), 6. 43 (d, J = 8. 4Hz, 1H), 6. 24 (q, J =4. 8Hz, 1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 55 (s, 2H), 3. 19-3. 10 (m, 1H), 2. 96-2. 92 (m, 2H), 2. 74 (d, J = 5. 1Hz, 3H), 2. 23-2. 11 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 620. 55[M+H]+.
[0185] 實(shí)施例13
[0186] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(吡啶-3-基）脲（GL-12)
[0187]
[0188] 按上述反應(yīng)式，GL-12是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（43mg，收 率 36% )。mp212-213°C ? NMR(300MHz，DMS0-d6) S 9. 14(s，1H)，8. 97(s，1H)，8. 62(d，J = 2. 4Hz，1H)，8. 32-8. 28 (m，2H)，8. 21 (dd，J = 4. 8, 1. 5Hz，1H)，7. 99-7. 95 (m，1H)，7. 61-7. 57 (m，2H)，7. 36 - 7. 27 (m，6H)，4. 07-4. 04 (m，4H)，3. 82-3. 79 (m，4H)，3. 56 (s，2H)，3. 25-3. 08 ( m, 1H), 3. 03-2. 82 (m, 2H), 2. 16-1. 98 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 591. 58[M+H]+.
[0189] 實(shí)施例14
[0190] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲氧基脲（GL-13)
[0191]
[0192] 按上述反應(yīng)式，GL-13是用相應(yīng)胺的鹽酸鹽通過脲的合成通法合 成的黃色固體（52mg，收率 48 % )。mpl54-155 °C NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 9. 61 (s, 1H), 9. 09 (s, 1H), 8. 27 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 73 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 35 -7. 23 (m, 5H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 65 (s, 3H), 3. 54 (s, 2H), 3. 20-3. 11 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 10. 8Hz, 2H), 2. 23-2. 11 (m, 4H), 2. 04 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 544. 33 [M+H]+.
[0193] 實(shí)施例15
[0194] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2_羥乙基）脲（GL-14)
[0195]
[0196] 按上述反應(yīng)式，GL-14是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（76mg，收 率 68 % )。mpl27-129。(： ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 83 (s，1H)，8. 26-8. 21 (m，2H)，7. 52 -7. 48 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 27 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 76 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 46 (q, J = 5. 7Hz, 2H), 3. 18 (q, J = 5. 4Hz, 2H), 3. 15 - 3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 558. 40[M+H]+.
[0197] 實(shí)施例16
[0198] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_苯脲（GL-15)
[0199]
[0200] 按上述反應(yīng)式，GL-15是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的白色固體（61mg，收 率 52% )。11^201-202。(： "H NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.94(s，lH)，8.72(s，1H)，8.31_8.28( m, 2H), 7. 60-7. 57 (m, 2H), 7. 49-7. 46 (m, 2H), 7. 36 - 7. 23 (m, 7H), 6. 99 (t, J = 7. 5Hz, 1H), 4 .07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. ll(m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 2 2-2. ll(m, 4H),2. 05 - 1.92(m, 2H). ESI-MS:m/z = 590. 48[M+H]+.
[0201] 實(shí)施例17
[0202] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基）苯基）脲（GL-16)
[0203]
[0204] 按上述反應(yīng)式，GL-16是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（95mg，收 率 69% )。mp216-218°C ? NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 84(s，1H)，8. 45(s，1H)，8. 28(d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 56 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 24 (m, 7H), 6. 89 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 4. 07-4. 04 (m，4H)，3. 81-3. 79 (m，4H)，3. 54 (s，2H)，3. 19-3. 11 (m，1H)，3. 07 - 3. 04 (m，4H)，2. 93 (d，J =11. 1Hz, 2H), 2. 47 - 2. 44 (m, 4H), 2. 22 (s, 3H), 2. 22 - 2. 11 (m, 4H), 2. 04-1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 688. 44[M+H]+.
[0205] 實(shí)施例18
[0206] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4-(吡咯烷-1-基）苯基）脲（GL-17)
[0207]
[0208] 按上述反應(yīng)式，GL-17是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體 (70mg，收率 53 % )。mp221-223。(： NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.79(s，lH)，8.30(s， 1H)，8. 29-8. 25 (m，2H)，7. 57-7. 54 (m，2H)，7. 36-7. 23 (m，7H)，6. 50 (d，J = 9. 3Hz，2H ),4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 21-3. 11 (m, 5H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 23-2. ll(m, 4H), 2. 04 - 1.92(m, 6H). ESI-MS:m/z = 659. 44[M+H]+.
[0209] 實(shí)施例19
[0210] 利用GL-1制備4-(4-(3-(4-(3-(l-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）脲基）苯基）哌嗪-1-甲酸叔丁酯（GL-18)
[0211]
[0212] GL-18是用相應(yīng)的胺通過和GL-10相同方法合成的黃色固體（78mg，收率 50 % )。mp 156-158。(： ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 8. 86 (s，1H)，8. 49 (s，1H)，8. 28 (d，J = 9. 0Hz, 2H), 7. 58 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 36 - 7. 25 (m, 7H), 6. 92 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 55 (s, 2H), 3. 47-3. 44 (m, 4H), 3. 19-3. 10 (m, 1H), 3. 03-2. 99 (m ,4H), 2. 96-2. 92 (m, 2H), 2. 23 - 2. 12 (m, 4H), 2. 05-1. 94 (m, 2H), 1. 42 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 774. 58 [M+H]+.
[0213] 實(shí)施例20
[0214] 利用GL-18制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-5-基）苯基）-3- (4-(哌嗪-1-基）苯基）脲（GL-19)
[0215]
[0216] 將 GL-18(45mg，0. 058mmol)溶解在 0. 5mL DCM 中，然后加入 2mL TFA，室溫下 攪拌反應(yīng)2h。減壓蒸干溶劑，加入乙醇再減壓蒸干，殘余物加入DCM和6N NaOH水溶 液并萃取。有機(jī)相減壓濃縮通過柱層析和制備薄層色譜純化得黃色固體（19mg，收率 49 % )。mp 156-158。(： ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 9. 04 (s，1H)，8. 67 (s，1H)，8. 27 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 57 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 7H), 6. 88 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 5. 52 -4. 31 (brs, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 3. 0 5-3. 02 (m, 4H), 2. 94 - 2. 91 (m, 6H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 03 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS :m/z = 674. 51[M+H]+.
[0217] 實(shí)施例21
[0218] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4_氟苯基）脲（GL-20)
[0219]
[0220] GL-20是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的黃色固體（68mg，收率45% )。 8. 7Hz, 2H), 7. 58 (d, J = 8. 7Hz, 2H) ,7.52 - 7. 45 (m, 2H), 7. 36 - 7. 23 (m, 5H) ,7.18-7. 10 (m, 2H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 2. 95-2. 92 (m, 2H),2. 23-2. ll(m, 4H), 2. 04 - 1.93(m, 2H). ESI-MS :m/z = 608. 38[M+H]+.
[0221] 實(shí)施例22
[0222] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2, 2, 2-三氟乙基）脲（GL-21)
[0223]
[0224] GL-21是用相應(yīng)胺的鹽酸鹽通過脲的合成通法合成的白色固體（81mg， 收率 54 % )。mp 197-198 °C /HNMR (300MHz, DMS0-d6) 59.02 (s，lH), 8. 28-8. 24 (m, 2H), 7. 56-7. 51 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 80 (t, J = 6. 6Hz, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 99-3. 90 (m, 2H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d ,J = 11. 1Hz, 2H), 2. 10-2. 22 (m, 4H), 2. 05 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS :m/z = 596. 35[M+H]+.
[0225] 實(shí)施例23
[0226] 利用GL-1通過脲的合成通法制備1- (4- (3- (1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2, 2-二氟乙基）脲（GL-22)
[0227]
[0228] GL-22是用相應(yīng)的胺通過脲的合成通法合成的白色固體（68mg，收率49% )。 mp 185-186 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 97 (s, 1H), 8. 25 (d, J = 9Hz, 2H), 7. 52 (d, J =8. 7Hz, 2H), 7. 42 - 7. 16 (m, 5H), 6. 55 (t, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 27-5. 88 (m, 1H), 4. 05 -4. 03 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 1H), 3. 62-3. 48 (m, 4H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 10 - 2. 22 (m, 4H), 2. 04 - 1. 19 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 578. 39[M+H]+.
[0229] 實(shí)施例24
[0230] 利用GL-1通過制備N-異丙基-4- (5- (4- (3-異丙脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-甲酰胺（GL-23)
[0231]
[0232] 將 GL-l(80mg，0. 17mmol)溶解在 2mL 無水 DCM 中并加入三乙胺（52mg，0. 51mmol)， 混合物在冰浴下冷卻。然后加入三光氣（31mg，0. lmmol)，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應(yīng)15min。 1-甲基乙胺（50mg，0.85mmol)的無水DCM溶液加到上述反應(yīng)液中并攪拌過夜。加入 水，DCM萃取，有機(jī)相減壓濃縮，粗品通過柱層析和制備薄層色譜純化得黃色固體（41mg， 收率 44 % )。mp 223-225 °C NMR (300MHz，DMS0-d6) 58.59 (s，lH)，8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 48 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 25 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 6. 08 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 4. 09-4. 05 (m, 6H), 3. 81-3. 74 (m, 6H), 3. 37-3. 31 (m, 1H), 2. 91 (t, J = 10. 8Hz, 2H), 2. 04-1. 83 (m, 4H), 1. ll(d, J = 3. 6Hz, 6H), 1.09(d, J = 3. 6Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 551. 46 [M+H]+.
[0233] 實(shí)施例25
[0234] N-甲基-4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基） 哌啶-1-甲酰胺（GL-24)的制備
[0235]
[0236] GL-24是從GL-2的合成過程中分離得到的副產(chǎn)物。mp 174-176 °C . 4 NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 80 (s, 1H) , 8. 23 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 51 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 49 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06-4. 0 (m, 6H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 40-3. 32 (m, 1H), 2. 94 (t, J = 11. 7Hz, 2H), 2. 64 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 62 (d, J = 4. 2Hz, 3H), 2. 07-2. 02 (m, 2H), 1. 94-1. 80 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 495. 4 [M+H]+.
[0237] 實(shí)施例26
[0238] 利用GL-1制備1-(4-(3-(1_芐基哌啶-4-基）-7_嗎啡啉基異噁唑[4,5_d]并嘧 啶-5-基）苯基）-3-甲基硫脲（GL-25)
[0239]
[0240] 將GL-1 (141mg，0. 3mmol)溶解在3mL無水二氧六環(huán)中，加入甲基異硫氰酸酯 (24mg，0. 33mmol)回流反應(yīng)18h。補(bǔ)加甲基異硫氰酸酯（llmg，0. 15mmol)繼續(xù)回流反應(yīng)24h。 反應(yīng)液濃縮至干加入水和DCM萃取。有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗，減壓濃縮，殘余物通過柱 層析和薄層色譜純化后再用乙醚洗滌產(chǎn)品得黃色固體（44mg，收率30% ) mp 175-177°C . 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 9. 78 (s，1H)，8. 30 (d，J = 8. 7Hz，2H)，7. 84 (s，1H)，7. 55 (d，J = 8. 4Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 4. 06 - 4. 02 (m, 4H), 3. 81-3. 80 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 20 -3. 10(m, 1H),2. 95-2. 91 (m, 5H), 2. 22 - 1.94(m, 6H). ESI-MS:m/z = 544. 34[M+H]+.
[0241] 實(shí)施例27
[0242] 4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌 啶-1-甲酸叔丁酯（GL-37)和1-甲基-3- (4- (7-嗎啡啉-3-(哌啶-4-基）異噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）脲雙三氟乙酸鹽（GL-26)的制備
[0243]
[0244] 將 GL-l(471mg，lmmol)溶解在 4mL DCM 中，加入三乙胺（126mg，1.25mmol)。甲 氨基甲酰氯（103mg，l. lmmol)的DCM溶液緩慢加到上述混合物中，升溫回流反應(yīng)3d。加 入水，DCM萃取，水和飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相，減壓濃縮所得殘余物通過柱層析純化得 GL-2(447mg，收率 71% )。
[0245]
[0246] 將 GL-2(1. 342g，2. 54mmol)溶解在 40mL DCE 中再加入 ACE-C1(2. 910g， 20. 35_〇1)，室溫下攪拌過夜。反應(yīng)液濃縮至干，加入甲醇回流反應(yīng)2h。減壓蒸干甲醇得脫 芐基成鹽酸鹽的粗品（1.218g)。向所得粗品中加入50mL DCM和三乙胺（936mg，9. 25mmol) 并在冰浴下冷卻到〇°C。將（Boc)20(618mg，2. 83mmol)的DCM溶液滴加到上述反應(yīng)液中 攪拌反應(yīng)3h。加入水，DCM萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，有機(jī)相減壓濃縮，柱層 析純化得白色固體 GL-37(1. 037g，收率 76% )。mp 152-154°C ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 22 (d, J = 9. 0Hz, 2H) , 7. 50 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 39 (tt, J = 10. 8, 3. 9Hz, 1H), 3. 1 4-2. 86(m, 2H), 2. 66(d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 09-1. 84(m, 4H), 1. 45 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 538. 10[M+H]+.
[0247]
[0248] GL-37(330mg，0. 61mmol)溶解在 lmL DCM 中，加入 3mL TFA，室溫下攪拌反應(yīng) 2h， 減壓蒸干，加入EtOH再減壓蒸干，重復(fù)三次以除去殘留三氟乙酸得黃色固體（405mg，收率 gg^hmpsiimr.iHNMRGooMHz.DMso-cgss.sguiHhs.soueo^iHhs.ei-s. 50 (m, 1H), 8. 28 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 53 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 21 (s, 1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 55 (tt, J = 10. 8, 3. 9Hz, 1H), 3. 46-3. 41 (m, 2H), 3. 22-3. 12 (m, 2H), 2. 66 (s, 3H), 2. 34-2. 12 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 438. 62[M+H]+.
[0249] 實(shí)施例28
[0250] 利用GL-26制備l-(4-(3-(l-乙基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-27)
[0251]
[0252] 將 GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在乙腈中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)，冰鹽浴降 溫，將碘乙烷（29mg，0. 18mmol)的乙腈溶液緩慢滴加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh，升至室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)5h。TLC監(jiān)測未反應(yīng)完，在65°C下反應(yīng)llh，然后回流反應(yīng)8h。蒸干溶劑加入水， DCM萃取，再在pH = 14條件下用DCM/H20 = 20/1萃取，所得有機(jī)相柱層析純化得黃色固體 GL-27 (48mg，收率69%)。11^ 209-210。(：.111匪1?(30011抱，01^0-(16)5 8.76(8，111)，8.26-8. 20 (m, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 -3. 78 (m, 4H), 3. 15-3. 06 (m, 1H), 2. 99-2. 95 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 38 (q, J = 7. 2Hz, 2H), 2. 13-1. 90 (m, 6H), 1. 04 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 466. 74[M+H]+.
[0253] 實(shí)施例29
[0254] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (4-氟芐基）哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-28)
[0255]
[0256] 將 GL_26(100mg，0. 15mmol)懸浮在乙腈中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)，室溫下 攪拌2h。冰鹽浴降溫，將對氟溴芐（35mg，0. 18mmol)的乙腈溶液緩慢滴加到反應(yīng)液中， 繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh，然后室溫下攪拌過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。濃縮，加入水，DCM萃取，有 機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，減壓濃縮，殘余物通過柱層析純化得黃色固體（72mg，收率 88% ) 〇 mp 164-165°C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25 - 8. 21 (m, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 7. 41-7. 34 (m, 2H), 7. 20 - 7. 12 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 2Hz, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 52 (s, 2H), 3. 13-3. 08 (m, 1H), 2. 93-2, 89 (m, 2H), 2. 67 (d ,J = 4. 8 Hz, 3H),2. 14-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 546. 44 [M+H]+.
[0257] 實(shí)施例30
[0258] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(7-嗎啡啉-3-(1_(吡啶-3-甲基）哌啶-4-基） 異惡唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-29)
[0259]
[0260] 將 GL-26 (100mg，0? 15mmol)懸浮在乙臆中加入 DIPEA (117mg，0? 91mmol)，冰鹽浴 降溫，3-溴甲基P比啶鹽酸鹽（46mg，0. 18mmol)加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh，室溫下攪拌 過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)液減壓濃縮，加入水，DCM萃取，有機(jī)相濃縮，柱層析純化得黃 色固體（50mg，收率63%)。11^ 146-148。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)5 8.79(8，111)，8.58- 8. 53 (m, 1H) ,8.52 - 8. 46 (m, 1H), 8. 28-8. 18 (m, 2H), 7. 84-7. 7 (m, 1H), 7. 57-7. 46 (m, 2H), 7. 43 - 7. 33 (m, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 19-3. 91 (m, 4H), 3. 90-3. 70 (m, 4H ),3. 59 (s, 2H), 3. 23-3. 05 (m, 1H), 3. 04-2. 80 (m, 2H), 2. 67 (d, J = 4. 2Hz, 3H) ,2.22-1.92(m, 6H). ESI-MS:m/z = 529. 65[M+H]+.
[0261] 實(shí)施例31
[0262] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(3-(1_(甲磺?；┻哙?4-基）-7-嗎啡啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-30)
[0263]
[0264] 將GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在無水 THF 中加入三乙胺（76mg，0. 75mmol)，冰浴 降溫，甲磺酰氯（29mg，0. 18mmol)的THF溶液緩慢滴加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh，室溫 下反應(yīng)15h。TLC未反應(yīng)完全，回流反應(yīng)6h。抽濾析出的固體，濾液減壓濃縮，然后加入水和 DCM萃取，有機(jī)相和濾餅結(jié)合柱層析純化得白色固體（45mg，收率58% )。mp 261-263°C . 4 匪R (300MHz，DMS0-d6) S 8. 77 (s，1H)，8. 25-8. 22 (m，2H)，7. 53-7. 5 (m，2H)，6. 08 (q，J = 4. 5Hz, 1H), 4. 05-4. 04 (m, 1H), 3. 82-3. 80 (m, 2H), 3. 69-3. 65 (m, 2H), 3. 37-3. 30 (m, 1H), 3. 0 5-2. 98 (m, 2H), 2. 93 (s, 3H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 29-2. 25 (m, 2H), 2. 09-1. 96 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 516. 52 [M+H]+.
[0265] 實(shí)施例32
[0266] 利用GL-26制備1-(4-(3-(1_乙?；?4-基）-7_嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-5-基）苯基）_3_甲脲（GL-31)
[0267]
[0268] GL-31是用乙酸酐通過過程B合成得到的土黃色固體（70mg，收率97 % )。mp 240-242 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25 - 8. 21 (m, 2H), 7. 54-7. 49 (m, 2H) ,6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 44-4. 39 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 96-3. 91 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 50-3. 39 (m, 1H) ,3.35 - 3. 26 (m, 1H), 2. 91-2. 82 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 22-2. 12 (m, 2H), 2. 06 (s, 3H), 1. 94 - 1. 70 (m, 2H). ESI-MS: m/z = 480. 57 [M+H]+.
[0269] 實(shí)施例33
[0270] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4_(7-嗎啡啉-3_(1-煙酰基哌啶-4-基）異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-32)
[0271]
[0272] GL-32是由3-吡啶甲酰氯鹽酸鹽通過過程B合成得到的黃色固體（58mg，收 率 72 % )。mp 158-160。(： ? 4 NMR(300MHz，DMS0_d6) S 8. 78 (s，1H)，8. 67 (dd，J = 4. 5. 1. 5Hz, 2H), 8. 26-8. 23 (m, 2H), 7. 89 (dt, J = 7. 8, 1. 8Hz, 1H), 7. 53-7. 48 (m, 3H), 6 .08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 66-4. 44 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 7 5-3. 61 (m, 1H), 3. 57-3. 48 (m, 1H), 3. 46-3. 27 (m, 1H), 3. 27-3. 06 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 39-2. 09 (m, 2H), 2. 04 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS: m/z = 543. 46 [M+H]+.
[0273] 實(shí)施例34
[0274] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (4-氟苯甲?；┻哙?4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-33)
[0275]
[0276] GL-33是由對氟苯甲酰氯通過過程B合成得到的白色固體（57mg，收率68% )。 mp 174-176 。(： /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.23(m，2H)，7.55- 7. 50 (m, 4H), 7. 33-7. 27 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 67-4. 30 (m, 1H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H), 3. 91 - 3. 61 (m, 5H), 3. 60-3. 44 (m, 1H), 3. 42-3. 0 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 08 (m, 2H), 2. 02 - 1. 89 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 560. 59[M+H]+.
[0277] 實(shí)施例35
[0278] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1-苯甲?；哙?4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-34)
[0279]
[0280] GL-34是由苯甲酰氯通過過程B合成得到的黃色固體（77mg，收率95% )。 mp 175-177 。(： ? 4 Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.22(m，2H)，7.54- 7. 50 (m, 2H), 7. 49-7. 42 (m, 5H), 6. 08 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 75-4. 35 (m, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 91 - 3. 61 (m, 5H), 3. 57-3. 46 (m, 1H), 3. 42-3. 0 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 08 (m, 2H), 2. 03 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 542. 70[M+H]+.
[0281] 實(shí)施例36
[0282] 利用GL-26制備4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-甲酸甲酯（GL-35)
[0283]
[0284] GL-35由氯甲酸甲酯通過過程B合成得到的白色固體（68mg，收率92 % )。 mp 228-230 °C /H Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.20(m，2H)，7.54-7. 49 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 64 (s, 3H) ,3. 42-3. 37 (m, 1H), 3. 14-3. 05 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 17-2. 11 (m, 2H), L 93 -1.80(m, 2H). ESI-MS:m/z = 496. 45[M+H]+.
[0285] 實(shí)施例37
[0286] 利用GL-26制備4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-甲酸異丙酯（GL-36)
[0287]
[0288] GL-36是由氯甲酸異丙酯通過過程B合成得到的白色固體（74mg，收率94% )。 mp 228-229 °C /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.78(s，lH)，8.24-8.20(m，2H)，7.53- 7. 48 (m, 2H) , 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H) , 4. 83 (sept, J = 6. 3Hz, 1H) , 4. 09 -4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 44-3. 35 (m, 1H), 3. 11-3. 01 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 13-2. 07 (m, 2H), 1. 95 - 1. 82 (m, 2H), 1. 23 (d, J = 6. 3Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 524. 37 [M+H]+.
[0289] 實(shí)施例38
[0290] 利用GL-26制備N, N-二甲基-4-(5-(4_(3-甲脲基）苯基）-7_嗎啡啉基異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-甲酰胺（GL-38)
[0291]
[0292] GL-38由二甲胺基甲酰氯通過過程B合成得到的白色固體（75mg，收率98% )。 mp 152-154 。(： ? 4 Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.21(m，2H)，7.53- 7. 49 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3 .68-3. 64 (m, 2H), 3. 41-3. 30 (m, 1H), 3. 89-3. 0 (m, 2H), 2. 78 (s, 6H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 14-2. 09 (m, 2H), 2. 02 - 1. 89 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 509. 34 [M+H]+.
[0293] 實(shí)施例39
[0294] 利用GL-26制備叔丁基（2-甲基-1-(4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-嗎啉基異 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-基）-1_氧代丙基-2-基）氨基甲酸酯（GL-39)
[0295]
[0296] GL-39是由GL_26(150mg，0. 23mmol)和2_(叔丁氧羰氨基）異丁酸通過過程 A 合成的黃白色固體（117 mg，收率84%)。mp lSO-lSST.1!! NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 53 - 7. 49 (m, 2H), 7. 35 (s, 1H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 50-4. 54 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 40-3. 3 7 (m, 1H), 3. 24-2. 79 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 29-2. 03 (m, 2H), 1. 97 -1. 72 (m, 2H), 1. 35 (s, 1H). ESI-MS:m/z = 623. 42 [M+H]+.
[0297] 實(shí)施例40
[0298] 利用GL-26制備1-(4-(3-(1-(2-氰乙基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-40)
[0299]
[0300] GL-40是由氰基乙酸通過過程A合成得到的黃色固體（44mg，收率58% )。mp 258-260 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 24 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 51 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 46-4. 3 (m, 1H), 4. 20-4. 04 (m, 6H), 3. 90-3. 68 (m, 5H), 3. 51 - 3. 44 (m, 1H), 3. 35 - 3. 27 (m, 1H), 3. 01-2. 94 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 21-2. 17(m, 2H), 2. 08-1. 94 (m, 1H), 1. 86-1. 73 (m, 1H). ESI-MS:m/z = 505. 72[M+H]+.
[0301] 實(shí)施例41
[0302] 利用GL-26制備1-甲基-3- (4- (7-嗎啡啉-3- (1- (2, 2, 2-三氟乙基）哌啶-4-基） 異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-41)
[0303]
[0304] 將 GL-26 (100mg，0? 15mmol)懸浮在乙醇中加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和三 氟甲磺酸三氟乙酯（51mg，0.22mmol)，升溫回流反應(yīng)12h，TLC監(jiān)測未反應(yīng)完全，補(bǔ)加 DIPEA(23mg，0. 18mmol)和三氟甲磺酸三氟乙酯（21mg，0.09mmol)，繼續(xù)回流反應(yīng)5h。反 應(yīng)液減壓濃縮，加入水，DCM萃取，有機(jī)相減壓濃縮，柱層析純化得黃色固體（77mg，收率 98% ) 〇 mp 229-230°C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25-8. 21 (m, 2H) ,7.54-7. 50 (m, 2H) , 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03(m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 30-3. 20 (q, J = 10. 2Hz, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 3. 08-3. 02 (m, 2H), 2. 66 (d ,J = 4. 8Hz, 3H), 2. 63-2. 54(m, 2H), 2. 15 - 2. 09(m, 2H), 2. 05-1. 92(m, 2H). ESI-MS:m/z = 520. 41[M+H]+.
[0305] 實(shí)施例42
[0306] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(3-(l-(2_(甲砜基）乙基）哌啶-4-基）-7_嗎 啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-42)
[0307]
[0308] 將 GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在 n-BuOH 中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)、 2-甲砜基溴乙烷（4111^，0.22臟〇1)和恥1(4111^，0.27臟〇1)，室溫下攪拌，11(：監(jiān)測反應(yīng) 完成，抽濾得蒼黃色固體（70mg，收率 85%)。mp NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 9. 23 (s, 1H), 8. 22-8. 19 (m, 2H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 6. 44 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 36 - 3. 32 (t, J = 6. 3Hz, 2H), 3. 19 - 3. 07 (m, 1H), 3. 09 ( s, 3H), 3. 04-3. 0 (m, 2H), 2. 78 (t, J = 6. 6Hz, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 26-2. 19 (m, 2H) ,2. 12-1. 95 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 544. 57[M+H]+.
[0309] 實(shí)施例43
[0310] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(7-嗎啡啉-3-(1-三氟乙?；哙?4-基）異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-43)
[0311]
[0312] GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在乙腈中加入三乙胺解離，所得混合物減壓濃縮 至干，加入無水DCM，冰鹽浴降溫，緩慢滴加2eq TFAA。滴完室溫下攪拌過夜，TLC監(jiān)測 反應(yīng)未完成，補(bǔ)加1.2eq TFAA反應(yīng)液立刻變澄清。反應(yīng)液加入水，DCM萃取，有機(jī)相用 水和飽和氯化鈉洗滌，柱層析純化得白色固體（56mg，收率70% )。mp 203-205 °C NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 24-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q ,J = 4. 8Hz, 1H), 4. 39-4. 32 (m, 1H), 4. 06 - 3. 98 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 64 -3. 52 (m, 2H), 3. 30 - 3. 22 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 27 (m, 2H), 2. 08-1. 86 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 534. 59[M+H]+.
[0313] 實(shí)施例44
[0314] 利用GL-39制備1-(4-(3-(1-(2-氨基-2-甲基丙?；┻哙?4-基）-7-嗎啡啉 基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲三氟乙酸鹽（GL-44)
[0315]
[0316] GL-39(100mg，0. 16mmol)溶解在DCM中加入2mL TFA，室溫下攪拌反應(yīng)2h，濃縮 至干加入乙醇，再濃縮并加入石油醚，抽濾析出的固體得黃色產(chǎn)物（107mg，收率100% )。 mp 178-180 °C ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 88 (s，1H)，8. 24-8. 21 (m，2H)，8. 18 (s，3H)，7 .54-7. 51 (m, 2H), 6. 20 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 49-4. 20 (m, 2H), 4. 07 - 4. 04 (m, 4H), 3. 81 -3. 79 (m, 4H), 3. 61 - 3. 52 (m, 1H), 3. 40 - 3. 03 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 24-2. 20 (m ,2H), 2. 00-1. 98 (m, 2H), 1. 62 (s, 6H). ESI-MS:m/z = 523. 74[M+H]+.
[0317] 實(shí)施例45
[0318] 利用GL-26制備N, N-二甲基-2-(4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰胺（GL-45)
[0319]
[0320] GL-26 (100mg，0? 15mmol)懸浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和 2_氯-N，N_二甲基乙酰胺（25mg，0.21mmol)，室溫下攪拌過夜，加入Nal(27mg，0.18mmol) 繼續(xù)攪拌反應(yīng)l〇h。減壓濃縮，加入水，DCM萃取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，柱層析 得黃白色固體（70mg，收率 90%)。mp lSQ-ieor.1!! NMR(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH ),8. 24-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 15-3. 94 (m, 4H), 3. 90 - 3. 66 (m, 4H), 3. 20 (s, 1H) ,3.16- 3. 09 (m, 1H), 3. 07 (s, 3H), 2. 97-2. 93 (m, 2H), 2. 83 ( s, 3H), 2. 66(d, J = 4. 2Hz, 3H), 2. 33-2. 26 (m, 2H), 2. 11-1. 94(m, 4H). ESI-MS:m/z = 523. 80[M+H]+.
[0321] 實(shí)施例46
[0322] 利用GL-26制備2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰胺（GL-46)
[0323]
[0324] 將 GL-26 (100mg，0? 15mmol)懸浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和 2_ 鵬 代乙酰胺（37mg，0.20mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)液減壓濃縮，殘余物溶解在氯仿 和甲醇中，加入水，氯仿萃取，有機(jī)相水和飽和氯化鈉洗滌，減壓濃縮，抽濾得黃白色固體 (86mg，收率 100 % )。mp 186-188。(： ? 4匪1?(30011抱，01^0-(16)5 8.99(8，111)，8.26-8. 20 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 7. 24 (s, 1H), 7. 13 (s, 1H), 6. 25 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 04 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 15-3. 09 (m, 1H), 2. 96-2. 92 (m, 4H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 35-2. 26 (m, 2H), 2. 14 - 1. 99 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 495. 70[M+H]+.
[0325] 實(shí)施例47
[0326] 利用GL-26制備1-(4-(3-(1-(2-羥乙基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-47)
[0327]
[0328] 將 GL-26(100mg，0. 15mmol)懸浮在乙醇中，加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)、 Nal(27mg，0. 18mmol)和2-溴乙醇（25mg，0.20mmol)，回流反應(yīng)60h。減壓濃縮，加入水， 氯仿萃取，萃不干凈，在pH = 14下萃取，所得有機(jī)相柱層析純化得黃色固體（50mg，收率 69 % )。mp 198-199 °C ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 77 (s，1H)，8. 24-8. 21 (m，2H)，7. 53 -7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 41 (t, J = 5. 1Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (q, J = 6. 0Hz, 2H), 3. 11 - 3. 06 (m, 1H), 3. 01-2. 97 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 45(t, J = 6. 3Hz, 2H), 2. 23-2. 16 (m, 2H), 2. 11-1. 92 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 482. 70 [M+H]+.
[0329] 實(shí)施例48
[0330] 利用GL-26制備2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰乙酸乙酯（GL-48)
[0331]
[0332] GL-26 (100mg，0? 15mmol)懸浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和漠 乙酸乙酯（36mg，0. 22mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)5h。反應(yīng)液減壓濃縮，加入水，DCM萃 取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，濃縮柱層析純化得黃色固體（66mg，收率84% )。 mp 22卜223 。(： /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.25-8.21(m，2H)，7.54-7.4 9 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 11 (q, J = 7. 2Hz, 2H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 -3. 78 (m, 4H), 3. 29 (s, 2H), 3. 17 - 3. 07 (m, 1H), 2. 98-2. 94 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2 .48-2. 39 (m, 2H), 2. 13-1. 93 (m, 4H), 1. 22 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 524. 45 [M+H]+.
[0333] 實(shí)施例49
[0334] 利用GL-26制備1-(4-(3-(1-(2-甲氧基乙基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-49)
[0335]
[0336] GL-26 (lOOmg，0? 15mmol)懸浮在乙醇中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)、 Nal(27mg，0. 18mmol)和 2-甲氧基溴乙燒（27mg，0. 20mmol)，回流反應(yīng)，TLC 監(jiān)測 原料不再減少。反應(yīng)液減壓濃縮，加入水，DCM萃取，不能完全萃出產(chǎn)物，再在pH =14條件下萃取，所得有機(jī)相通過柱層析純化得黃色固體（45mg，收率61 % )。mp 208-210 °C /H 匪 R(300MHz，DMS0-d6) 58. 77(s，lH)，8.24-8.21(m，2H)，7.53-7.50( m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 48 (t, J = 5. 7Hz, 2H), 3. 26 (s, 3H), 3. 16 - 3. 09 (m, 1H), 3. 03-2. 98 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 60-2. 50 (m, 2H), 2. 27-2. 16 (m, 2H), 2. 12-1. 92 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 496. 57 [M+H]+.
[0337] 實(shí)施例50
[0338] 利用GL-48制備2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-基）乙酸二三氟乙酸鹽（GL-50)
[0339]
[0340] GL-48(110mg，0. 21mmol)溶解在 MeOH 中，加入 0? 21mL 2N NaOH 溶液，回流 反應(yīng)6h。反應(yīng)液冷卻，濃鹽酸調(diào)pH = 6,加入水，減壓濃縮，殘余物抽濾，濾餅干燥 后在室溫下在TFA中攪拌lh。減壓蒸干TFA得黃色固體（104mg，收率68% )。mp 240-242 °C . :H NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 10. 05 (s, 1H), 8. 87 (s, 1H), 8. 28-8. 25 (m, 2H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 6. 26-6. 11 (m, 1H), 5. 42 (s, 2H), 4. 19 (s, 2H), 4. 09-4. 02 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 75-3. 43 (m, 3H), 3. 43-3. 19 (m, 2H), 2. 66 (s, 3H), 2. 47-2. 16 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 496. 68[M+H]+.
[0341] 實(shí)施例51
[0342] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (2-羥基-2-甲基丙酰基）哌啶-4-基）-7-嗎啡啉 基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-51)
[0343]
[0344] GL-51是由2-羥基異丁酸通過過程A合成得到的黃色固體（75mg，收率95% )。 mp 165-167 °C . NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 78 (s, 1H), 8. 25-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 49 (m ,2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 5. 44 (s, 1H), 5. 12-4. 69 (m, 1H), 4. 69-4. 32 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 1H), 3. 52-3. 42 (m, 1H), 3. 28-3. 05 (m, 1H), 3. 05-2. 77 (m, 1H), 2. 66(d, J = 4. 5Hz, 3H),2. 18-2. 12 (m, 2H), 2. 06-1. 70 (m, 2H), L 36 (s, 6H). ESI-MS:m/z = 524. 48 [M+H]+.
[0345] 實(shí)施例52
[0346] 利用GL-26制備4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）-N-吡啶-3-基）哌啶-1-硫代甲酰胺（GL-52)
[0347]
[0348] GL-26 (100mg，0. 15mmol)懸浮在乙腈中，加入3-棄硫氰酸酯基P比啶（50mg， 0. 37mmol)和DIPEA(28mg，0. 22mmol)，回流反應(yīng)5h。減壓濃縮至干，加入水，DCM萃 取，有機(jī)相用水和飽和氯化鈉洗滌，減壓濃縮，柱層析純化得黃色固體（86mg，收率 100 % )。mp 183-185 °C ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) 59.51 (s，lH), 8.79 (s，lH)，8.51 (d，J =2. 4Hz, 1H), 8. 32-8. 30 (m, 1H), 8. 28-8. 25 (m, 2H), 7. 80 - 7. 76 (m, 1H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 7. 37 (dd, J = 8. 1, 4. 5Hz, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 85-4. 80 (m, 2H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H) ,3.82 - 3. 80 (m, 4H), 3. 65-3. 55 (m, 1H), 3. 52-3. 44 (m, 2H), 2. 67 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 25-1. 98 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 574. 26[M+H]+.
[0349] 實(shí)施例53
[0350] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(7-嗎啉-3-(1-三氟甲磺?；哙?4-基）異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-53)
[0351]
[0352] GL-26(137mg，0.21mmol)懸浮在無水 THF 中，加入 DIPEA(96mg，0.74mmol)，冰浴 下冷卻，將三氟甲磺酰氯（51mg，0. 30mmol)的THF溶液滴加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh， 室溫下攪拌過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)未完全，升溫至40°C反應(yīng)5h并補(bǔ)加三氟甲磺酰氯（40mg， 0. 25mmol)。反應(yīng)液濃縮，加入水，DCM萃取，有機(jī)相減壓濃縮制備薄層色譜純化得白色固體 (30mg，收率 26% )。mp 238-24(TC ? iHNMRGOOMHz, DMS0-d6) S 8. 78 (s, 1H)，8. 26-8. 21 (m, 2H ),7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 07 - 4. 04 (m, 4H), 3. 97-3. 93 (m, 2H), 3. 81 - 3. 79 (m, 4H), 3. 58-3. 47 (m, 3H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 35-2. 21 (m, 2H), 2. 12 -1.99(m, 2H). ESI-MS:m/z = 570. 70[M+H]+.
[0353] 實(shí)施例54
[0354] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (2-氯乙酰基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-54)
[0355]
[0356] GL-54由氯乙酰氯通過過程B合成得到的黃色固體（38mg，收率49 % )。mp 157-158〇C . NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 54-7. 49 (m, 2H), 6 ? 07 (d, J = 4. 8Hz, 1H)，4. 50-4. 36 (m, 3H)，4. 06-3. 89 (m, 5H)，3. 81-3. 78 (m, 1H)，3. 54-3. 44 (m, 1H), 3. 39 - 3. 33 (m, 1H), 3. 02-2. 94 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 16-1. 76 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 514. 71[M+H]+.
[0357] 實(shí)施例55
[0358] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (3, 3-二甲基丁酰基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_甲脲（GL-56)
[0359]
[0360] GL-56由3,3-二甲基丁酸通過過程A合成的白色固體（80mg，收率99% )。 mp 153-155 °C ? 4 M!R(300MHz，DMS0-d6)S8.76(s，lH)，8.2-8.20(m，2H)，7.52-7. 48 (m, 2H), 6. 06 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 60-4. 47 (m, 1H), 4. 13 - 4. 02 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 52-3. 40 (m, 1H), 3. 31 - 3. 25 (m, 1H), 2. 87-2. 78 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 30(q, J = 14. 1Hz, 2H), 2. 14 - 1. 77 (m, 4H), 1. 04 (s, 9H). ESI-MS: m/z = 536. 59 [M+H]+.
[0361] 實(shí)施例56
[0362] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (3, 5-二叔丁基苯甲酰基）哌啶-4-基）-7-嗎啉基 異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-57)
[0363]
[0364] GL-57是由3, 5-二叔丁基苯甲酸通過過程A合成的白色固體（66mg，收率 eT^hmplSS-lSgr.iHNMRGOOMHz.DMSO-cUSS.TSUlHhSJT-S^UmJHhT.SS-7. 48 (m, 3H), 7. 23 (d, J = 1. 8Hz, 2H), 6. 06 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 77-4. 24 (m, 1H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H) ,3.82 - 3. 59 (m, 5H), 3. 56-3. 46 (m, 1H), 3. 41 - 3. 02 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 17 - 1. 95 (m, 4H), 1. 30 (s, 18H). ESI-MS: m/z = 654. 93[M+H]+〇
[0365] 實(shí)施例57
[0366] 利用GL-26制備1- (4- (3- (1- (3, 5-二氟苯甲?；┻哙?4-基）-7-嗎啉基異噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_甲脲（GL-58)
[0367]
[0368] 61-58由3,5-二氟苯甲酸通過過程4合成的黃色固體（6〇11^，收率81%)。1^ 162-164 °C . NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H) ,7. 36 (tt, J = 9. 6, 2. 4Hz, 1H), 7. 22 - 7. 19 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 61-4. 39 (m ,1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 71-3. 59 (m, 1H), 3. 58-3. 47 (m, 1H), 3. 40-3 .30 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 37-2. 06 (m, 2H), 2. 04 - 1. 90 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 578. 74 [M+H]+.
[0369] 實(shí)施例58
[0370] 利用GL-26制備1-(4-(3-(1-(2-(4_氟苯基）乙?；┻哙?4-基）-7_嗎啉基 異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-59)
[0371]
[0372] GL-59由GL-26 (86mg，0. 13mmol)和對氟苯乙酸通過過程A合成的黃色固體 (68mg，收率93%)。11^ 138-140。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.78(8，111)，8.25-8. 20 (m, 2H), 7. 54 - 7. 50 (m, 2H) ,7.33 - 7. 28 (m, 2H), 7. 17 - 7. 09 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 47-4. 42 (m, 1H), 4. 10-4. 03 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 6H), 3. 45 (tt, J = 11. 1, 3. 6Hz, 1H), 3. 33-3. 26 (m, 1H), 2. 94-2. 87 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 15-2. 09 (m, 2H), 1. 85-1. 72 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 574. 91[M+H]+.
[0373] 實(shí)施例59
[0374] 利用GL-26制備1-甲基-3-(4-(7-嗎啡啉-3-(1-(4-(三氟甲基）苯甲?；┻?啶-4-基）異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-60)
[0375]
[0376] GL-60由GL-26(85mg，0. 13mmol)和三氟苯甲酸通過過程A合成的黃白色固 體（70mg，收率90%)。11^ 208-210。(：.111匪1?(30011抱，01^0-(16)8 8.76(8，111)，8.26-8. 23 (m, 2H), 7. 84 (d, J = 8. 1Hz, 2H), 7. 67 (d, J = 8. 1Hz, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 6. 07 (q, J =4. 5Hz, 1H), 4. 66-4. 44 (m, 1H), 4. 06 - 4. 07 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 70-3. 58 (m, 1H) ,3. 58-3. 49 (m, 1H), 3. 43-3. 27 (m, 1H), 3. 25-3. 07 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 38-2. 08 (m, 2H), 2. 08-1. 81 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 610. 87[M+H]+.
[0377] 實(shí)施例60
[0378] 利用化合物1制備（3-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-5-基）苯基）甲醇（GL-61)
[0379]
[0380] 將 1 (207mg，0. 5mmol)、3_ 輕乙基苯棚酸（114mg，0. 75mmol)、Pd(Pcy3)2Cl2(19mg， 0. 025mmol)和CsF(228mg，1. 5mmol)放入三口瓶中，抽真空排氣再進(jìn)Ar氣，重復(fù)排氣進(jìn)氣三 次，注射4mL溶劑（NMP/water = 9/1)，在Ar氣保護(hù)下100°C反應(yīng)48h。反應(yīng)液中加入水和乙 酸乙酯萃取，有機(jī)相水洗再用飽和氯化鈉洗三次，減壓濃縮，柱層析和制備薄層色譜純化得 黃色固體（44mg，收率18%)。11^ 87-89°(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.32(8，111)，8.26-8. 23 (m, 1H), 7. 48-7. 43 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 5. 28 (t, J = 5. 7Hz, 1H), 4. 59 (d, J = 5. 7Hz, 1H), 4. 08 - 4. 05 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 22-3. 12 (m, 1H), 2. 95-2 .91 (m, 2H), 2. 23-1. 95 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 486. 55[M+H]+.
[0381] 實(shí)施例61
[0382] 利用化合物1制備3-(3_(l-芐基哌啶-4-基）-7_嗎啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧 啶_5_基）苯酚（GL-62)
[0383]
[0384] 將 1 (207mg，0. 5mmol)、3_ 羥基苯棚酸（103mg，0. 75mmol)、Pd(Pcy3)2Cl2(19mg， 0.025臟〇1)和〇8?(228111〖，1.51111]1〇1)置于三口瓶中抽真空排氣再進(jìn)41'氣，重復(fù)排氣進(jìn)氣 三次，注射4mL溶劑（NMP/water = 9/1)，在Ar氣保護(hù)下100°C反應(yīng)48h。反應(yīng)液中加入 水和乙酸乙酯萃取，有機(jī)相水洗再用飽和氯化鈉洗三次，減壓濃縮，柱層析和制備薄層色 譜純化得黃色固體（24mg，收率 10% )。mp 86-88°C ? 4 NMR(300MHz, CDC13) S 7. 93(d, J =7. 8Hz, 1H), 7. 83 (s, 1H), 7. 39 - 7. 25 (m, 5H), 6. 92 (dd, J = 7. 8, 1. 8Hz, 1H), 4. 13 -4. 10 (m, 4H) ,3.87 - 3. 84 (m, 4H), 3. 66 (s, 2H), 3. 19-3. 11 (m, 3H) ,2.33-2.11 (m, 7H). ESI-MS:m/z = 472. 31[M+H]+.
[0385] 實(shí)施例62
[0386] 制備1-(4-(3-(1-芐基哌啶-4-基）-7-嗎啡啉基異噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基） 苯基）-3-甲脲鹽酸鹽
[0387] 將GL-2 (528mg, lmmol)溶于10mL無水二氧六環(huán)中，加入0? 52mL自制的2. 3mol/ L的氯化氫無水二氧六環(huán)溶液，在室溫下攪拌過夜，減壓蒸干二氧六環(huán)，加入10mL無水二 氯甲烷超聲洗滌，抽濾得白色固體（535mg，收率95% )。mp 255-257°C .ESI-MS:m/z = 528. 38 [M+H]+.
[0388] 試驗(yàn)實(shí)施例63
[0389] 本發(fā)明的具有式（I)結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，在抗腫瘤方
[0390] 面有明顯的效用，現(xiàn)通過以下藥理實(shí)驗(yàn)說明：
[0391] 通過CCK-8檢測試劑盒檢測化合物對3個(gè)腫瘤細(xì)胞株（U-87MG，、PC-3和BT-474) 的細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度IC 5。值。
[0392] 1、材料和方法
[0393] U-87MG人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（訂購于中科院上海細(xì)胞資源中心）
[0394] PC-3人前列腺癌細(xì)胞株（訂購于中科院上海細(xì)胞資源中心）
[0395] BT-474人乳腺癌細(xì)胞株（訂購于中科院上海細(xì)胞資源中心）
[0396] Cell Counting Kit~8(Cat#CK04-13, Dojindo)
[0397] % 孔培養(yǎng)板（Cat#35"，Corning Costar)
[0398] 胎牛血清（Cat#10099_141，GIBC0)
[0399] 培養(yǎng)基（Invitrogen)
[0400] 臺式酶標(biāo)儀 SpectraMax MfSMicroplate Reader (Molecular Devices)
[0401] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0402] 2. 1試劑配制
[0404] 化合物的制備：用DMS0稀釋化合物使終濃度為10mM。
[0405] 2. 2 IC5。實(shí)驗(yàn)（CCK-8 檢測）
[0406] 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃 度（依照細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果確定），接種96孔板，每孔加100 y L細(xì)胞懸液。細(xì)胞在 37°C，100%相對濕度，5% C02培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。用培養(yǎng)基將待測化合物稀釋至所設(shè)置 的相應(yīng)作用濃度（5X)，按25 y L/孔加入到細(xì)胞中?；衔镒饔媒K濃度從100 y M至0 y M，4 倍梯度稀釋，共10個(gè)濃度點(diǎn)；或從10 y M至0 y M，4倍梯度稀釋，共10個(gè)濃度點(diǎn)。然后將細(xì)胞 置于37°C，100%相對濕度，5% C02培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。吸棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8 的完全培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)。輕輕震蕩后在SpectraMax M5Microplate Reader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為參比，計(jì)算抑制率。
[0407] 3、數(shù)據(jù)處理
[0408] 按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率％ = [(Ac-As)/ (Ac-Ab)] X100%
[0409] As:樣品的0A (細(xì)胞+CCK-8+待測化合物）
[0410] Ac:陰性對照的 0A (細(xì)胞 +CCK_8+DMS0)
[0411] Ab:空白對照的0A (培養(yǎng)基+CCK-8+DMS0)
[0412] 運(yùn)用軟件 Graphpad Prism 5 并米用計(jì)算公式 log(inhibitor)vs. normalized response-Variable slope進(jìn)行IC5。曲線擬合并計(jì)算出IC5。值。
[0413] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0414]


[0417] 試驗(yàn)實(shí)施例64
[0418] 式（I)所示化合物作為PIK3抑制劑的作用，通過以下試驗(yàn)說明
[0419] 應(yīng)用 PI3_Kinase (human) HTRF? Assay kit 檢測待測化合物對 PI3K delta 酶的抑 制作用及半數(shù)抑制濃度（IC5。)。
[0420] 1、材料和儀器
[0421] 2104 EnVision? Multi label Reader (Cat: 2104-0010, PerkinElmer)
[0422] 384well opaque balck plate (Cat. 6007270, PerkinElmer)
[0423] PI 3-Kinase(human)HTRF? Assay kit (Cat. 33-016, Millipore)
[0424] 4X Reaction Buffer (Cat. 33-002,Millipore)
[0425] PIP21mM(Cat. 33-004,Millipore)
[0426] Stop A(Cat. 33-006,Millipore)
[0427] Stop B (Cat. 33-008, Millipore)
[0428] DM A (Cat. 33-010, Millipore)
[0429] DM B (Cat. 33-012, Millipore)
[0430] DM C(Cat. 33-014, Millipore)
[0431] PI3K delta(Cat. 14-604,Millipore)
[0432] ATP 10mM(cat PV3227, Invitrogen)
[0433] DTT 1M(cat D5545, Sigma)
[0434] 2、試劑配制
[0435] 2. 11 X Reaction Buffer
[0436] 4XReaction Buffer (Cat. 33_0〇2, Millipore)用 ddH20 稀釋至 IX，并加入1M DIT 使其終濃度為5mM。每次使用前新鮮配制。例如配制lOmL IX Reaction Buffer，加入2. 5mL 4XReaction Buffer，50yL 1M濃度的DIT和ddH20 7.45mL。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用新鮮配制的 1 X Reaction Buffer配制ATP工作液，底物和酶混合工作液等。
[0437] 2. 24 X化合物工作液
[0438] 初篩：待測化合物用DMS0溶解至50 y M作為儲存液，各取2 y L加入48 y L ddH20 中，得到2 y M含4 % DMS0的化合物溶液，混勻后各吸取2 y L加入18 y L 4 % DMS0(in ddH20)得到0. 2 y M化合物溶液。每個(gè)稀釋溶液各取5 y L加入384孔板中，這樣在最后的 20 y L激酶反應(yīng)體系中化合物的終濃度就分別是500nM和50nM并含有1 % DMS0。
[0439] IC5。：待測化合物用DMS0溶解至10mM作為儲存液，各取2 y L加入48 y L 1 XReaction Buffer中，得到400000nM含4% DMS0的化合物溶液，混勻后各吸取5 y L加 入下一個(gè)15 y L 4% DMS0(in 1 XReaction Buffer)的孔中，依次稀釋下去得到10個(gè)濃 度梯度。每個(gè)稀釋溶液各取5 y L加入384孔板中，這樣在最后的20 y L激酶反應(yīng)體系中 各個(gè)孔的化合物的終濃度就是 100000nM、25000nM、6250nM、1562. 5nM、390. 63nM、97. 65nM、 24. 42nM、6. 10nM、l. 53nM、0. 38nM并含有1% DMS0。10個(gè)測定濃度每個(gè)濃度為復(fù)孔。同時(shí) 選取CAL-101作為參考化合物，從2 y M開始4倍倍比稀釋化合物。
[0440] 2.32XPIP2 工作液
[0441] 用lXreaction buffer配制2XPIP2工作液，使其終濃度為20 yM，PIP2的反應(yīng) 終濃度為l〇yM，例如配制lmL lx reaction buffer/PIP2工作液，取20yL PIP2加入到 980 yL lXreaction buffer中。這個(gè)工作液要多配0.1-0.2mL,以滿足對照使用和死體 積。
[0442] 2. 42 X PIP2/ 激酶工作液
[0443] 用2 X PIP2工作液稀釋激酶，激酶工作液的濃度為80ng/wel 1。無激酶對照（可視 為100%抑制）即2XPIP2工作液。
[0444] 2.54XATP 工作液
[0445] 10mM的ATP用1 Xreaction buffer稀釋至40 u M。在20 u L激酶反應(yīng)體系中， ATP的濃度為10 y M。例如配制2mL ATP工作液，取8 y L 10mM濃度的ATP加入到1992 y L lXreaction buffer 中。
[0446] 2. 6終止液
[0447] Stop A和Stop B按3 :1的比例混合，室溫放置至少2小時(shí)后才可用，終止液可在 室溫下穩(wěn)定12個(gè)小時(shí)。
[0448] 2. 7檢測液
[0449] DM C、DM A和DM B按照18 :1 :1的比例混合，室溫放置至少2小時(shí)后才可用，檢測 液可在室溫下穩(wěn)定12個(gè)小時(shí)。
[0450] 3、實(shí)驗(yàn)流程
[0451] 實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。
[0452] 4、數(shù)據(jù)分析
[0453] 計(jì)算各孔的 Emission Ratio (ER)
[0454] Emission Ratio(ER) = 665nm Emission signal/620nm Emission signal
[0455] 100%抑制對照的平均 Emission Ratio 記為：ER100%
[0456] 0%抑制對照的平均Emission Ratio記為：ER0%
[0457] 抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=(ERSMple-ERQ% ) AER1QQ% _ERQ%) X 100 %
[0458] 運(yùn)用軟件Graphpad Prism 5進(jìn)行IC5。曲線擬合并計(jì)算出1C 5。值。
[0459] 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式（I)所示的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽， 其中，Ri為氨，W C I-Ce為取代基的可選取代的芳基，可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀燒 基，酷二胺基，W面素、W可選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基為取代基的芳基，W可選 取代的Ci-Ce直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基為取代基的化晚基，W可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈、 或環(huán)狀烷基為取代基的諷基，W可選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的橫酷 基，W可選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、化晚基、面代苯基、胺基、臘基、面代烷基為 取代基的幾基，可選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀醇基，醋基，酸基或簇基； Rz為氨，NHIV 或 NHCONHR3; 其中，所述Ri。為H或可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基；所述R 2'為H或W Ci- Ce直鏈、支鏈烷基、Cs-Ce環(huán)烷基為取代基的可選取代的酷胺基，W可選取代的Ci-Ce直鏈、 支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的=取代胺基，W-個(gè)、兩個(gè)或=個(gè)面原子為取代基的可選取代 的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，C I-Ce直鏈或支鏈烷氧基，可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈 或環(huán)狀醇基，贓嗦基化晚基，胺基化晚基，贓嗦基芳基或面素為取代基的芳基；其中贓嗦基 和胺基為W可選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基為取代基的取代贓嗦基和取代胺基； 所述Rs =可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基W及可選取代的芳基； R。為氨、徑基或可選取代的C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀醇基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的式（I)所示的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接 受的鹽，其特征在于， (1)當(dāng)Ri =可選取代的芳基，Rz= H時(shí)，Ro=-OH或Rn'OH，其中，R。'為可選取代的 Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； 當(dāng)Ri =可選取代的芳基，R。二H時(shí)，或NHIV，其中，Ri。為H或可選取代 的Ci-Ce直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基；R2' = H或CONHRs;其中，Rs= H，Ci-Ce直鏈、支鏈烷基， Cs-Ce環(huán)烷基，W C I-Ce直鏈或支鏈烷基為取代基的=取代胺基，一面代C I-Ce直鏈、支鏈 或環(huán)狀烷基，二面代Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、=面代C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，其中， 當(dāng)X = N時(shí)，所述Ra= H、 ；肆NHRe,其中，Rs、Re獨(dú)立地為Cl一 Ce直鏈或支鏈燒 基； 當(dāng)X = C時(shí)，所述Ra= H、 面素，其中，R7 = H、Cl-Ce烷基、BOC或-，0; 所述Rs為可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； 所述Re為可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； 似當(dāng)R。= H，R 1= NHCONHR3'時(shí)，Rz= CONHR…所述IV、Rii各自獨(dú)立地為H、可選取 代的Ci-Ce直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基； (3) 當(dāng)R。= H，Ri= H或Cl-Ce直鏈、支鏈烷基時(shí)；Rz= NHCONHR3, Rs為可選取代的Cl- Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； (4) 當(dāng)R。= H，Rz= NHCONHR 3,且Rs為可選取代的Cl一 Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基時(shí)，其中， 所述Rii、R2。、Rzi各自獨(dú)立地為H或可選取代的C 1一Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； 所述 Ri2、Ri3、Rl4a、Ri6、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、馬9、R3。、R3I、R32、R33、R34、各自獨(dú)立地為可 選取代的Ci-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基； 所述Rm為可選取代的C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或S面代C I-Ce直鏈、支鏈、或環(huán) 狀烷基； 所述Ru為可選取代的C 1-。2直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基或W面素或C I-Ce直鏈、支鏈或環(huán) 狀烷基為取代基的可選取代的芳控； 所述Ris、Ri迦立地為H、Boc或可選取代的C 1-C道鏈、支鏈、環(huán)狀烷基； 所述Y = F、C1、化或I ; 所述Z為F、Cl、Br、I或氨。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽，其特 征在于， (1)當(dāng)Ri =芐基，R2= H時(shí).R。為辟其、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或下醇； 當(dāng) Ri =芐基，R O=H 時(shí)1皿2' 或 NHCONHR3; 其中， 所述Ri。為H、甲基、乙基、丙基或下基； 所述 IV = H 或 CONHRs; 所述Rs= H、甲基、乙基、丙基、異丙基、下基、環(huán)丙烷基、二甲基乙基胺、氣代乙基、二氣 代乙基、S氣代乙基-O-Rs或R gOH ; 其中，當(dāng)X = N時(shí)，所述R4= H、NHRe,其中，Rs、Re獨(dú)立地為甲基、乙基、丙基 或下基；當(dāng)X = C時(shí)，所述Ra= H、所述R8為甲基、乙基、丙基或下基； 所述R9為甲基、乙基、丙基或下基； 似當(dāng)R。= H時(shí)，Ri=畑CONHRs'化二CONHR…所述IV、Rii各自獨(dú)立地為甲基，乙基、 丙基、異丙基或下基； (3) 當(dāng)R。= H時(shí)，Ri = H、甲基、乙基、丙基、異丙基或下基時(shí)；R2= NHCONHR3, Rs=甲基、 乙基、丙基、異丙基或下基； (4) 當(dāng)R。= H，R 2= NHCONHR 3, Rs=甲基、乙基、丙基、異丙基或下基時(shí)，所述Ri。、Rin R2。、Rzi各自獨(dú)立地為H或甲基、乙基、丙基、異丙基或下基； 所述 Ri2、Ri3、Ri6、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、尺29、R3。、R3I、R32、R33、R34各自獨(dú)立地為甲基、 乙基、丙基、異丙基、下基、異下基、環(huán)戊基或環(huán)己基； 所述Rm為甲基、乙基、丙基、異丙基、下基、一氣代C 1-C4直鏈或支鏈烷基、二氣代C 1-C4 直鏈或支鏈烷基、=氣代甲基、=氣代乙基、=氣代丙基、=氣代異丙基、=氣代下基或=氣 代異下基； 所述Ri5為甲基，乙基，丙基，異丙基，下基，異下基，環(huán)戊基，環(huán)己基，一氣代C 1-C4直鏈、 支鏈、環(huán)狀烷基，二氣代C1-C4直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基，=氣代C1-C4直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基，W氣 或C1-C4直鏈、支鏈、環(huán)狀烷基為取代基在對位、鄰位、間位取代或未取代的苯基； 所述Ris、Ri迦立地為H、甲基、乙基、丙基、異丙基、下基、異下基或Boc ; 所述Y = F ; 所述Z = F。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽，其特 征在于，為W下化合物之一：廣）5. 權(quán)利要求1所述的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽的制備方 法，其特征在于由化合物1制備而成，所述化合物1的制備方法為：6. 細(xì)胞毒性劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5中任一所述的喀晚衍生物及其多種晶 型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽。7. 藥物組合物，其特征在于，包含治療有效量的權(quán)利要求1-5中任一所述的的喀晚衍 生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽W及藥學(xué)上可接受的載體。8. 權(quán)利要求1-5任一所述的喀晚衍生物及其多種晶型體或其藥學(xué)上可W接受的鹽在 審Ij備細(xì)胞毒性劑W及抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求6所述的細(xì)胞毒性劑在制備針對PI3K激酶異常改變的藥物W及抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求7所述的藥物組合物在制備制備針對PI3K激酶異常改變的藥物W及抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK105985354SQ201510066655
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月9日
【發(fā)明人】郭家林, 裴亞中, 郎恒元
【申請人】南京蓋特醫(yī)藥技術(shù)有限公司, 吉林大學(xué)