高純度芝麻素單體和芝麻林素單體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物有效成分的分離純化方法，特別涉及高純度芝麻素和芝麻林素單體的制備方法，其包括(1)對(duì)芝麻回流提??；(2)用溶劑二次提?。?3)將A組分、B組分、C組分、D組分按體積比為1：0.2～1：0.5～3：0.2～1配成精制溶劑體系，得固定相和流動(dòng)相；(4)利用高速逆流色譜儀和所述的固定相和流動(dòng)相分離樣品，根據(jù)所得的色譜圖收集目標(biāo)組分，分別得到高純度的芝麻素單體和芝麻林素單體。本發(fā)明的制備方法的優(yōu)點(diǎn)是：重現(xiàn)性和分離效果好、效率高、芝麻素和芝麻林素單體產(chǎn)品的純度達(dá)到98％以上。
【專利說明】
高純度芝麻素單體和芝麻林素單體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物有效成分的分離純化方法，特別涉及高純度芝麻素和芝麻林素單 體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芝麻素和芝麻林素為存在于芝麻中的一類木脂素化合物，為芝麻的主要活性成 分。芝麻素(： 2。氏806,熔點(diǎn)121-122°C，其含量約占芝麻的0. 2%-0. 5%，大量研究表明芝麻 素可以抑制流感病毒、仙臺(tái)病毒和結(jié)核桿菌等病毒，同時(shí)具有降低膽固醇、促進(jìn)脂肪氧化、 抑制脂肪的合成、治療氣管炎、抗高血壓、抗癌等功效。農(nóng)業(yè)上用作除蟲菊酯的增劑。芝麻 林素也是芝麻中的主要木脂素類成分之一，分子式C 2(]H1S07，熔點(diǎn)93-94°C，藥理研究結(jié)果表 明芝麻林素具有抗氧化、清除自由基、降低膽固醇、抗血壓、抗血栓，并有促進(jìn)酒精代謝、保 肝解毒等功效，應(yīng)用前景廣闊。
[0004] 目前國內(nèi)尚未有對(duì)芝麻素和芝麻林素單體進(jìn)行分離的專利，現(xiàn)有關(guān)于高純度芝麻 素和芝麻林素單體分離制備的文獻(xiàn)方法主要采用反復(fù)硅膠柱層析、葡聚糖凝膠LH-20柱色 譜等方法，其局限性是費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對(duì)樣品有不可逆 性吸附作用，分離得到高純度芝麻素和芝麻林素單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為 制備量大的分離技術(shù)。
[0005] 高速逆流色譜（High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近 30 年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它 避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題，使用其它液相 色譜法進(jìn)行制備型分離時(shí)，其分配效率會(huì)顯著降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分 辨度，分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜能直接進(jìn) 大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達(dá)到相當(dāng)高的純度，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán) 保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。
[0006] 經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號(hào)為CN102093461A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種高速逆流色譜 純化茶皂素的方法，其包括：1)茶皂素粗品的制備；2)溶劑的配置；3)樣品制備；4)分離 純化。上述的高速逆流色譜純化茶皂素的方法，設(shè)計(jì)合理，本發(fā)明對(duì)油茶餅柏進(jìn)行預(yù)處理， 并選擇了正確的溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯、正丁醇和水，使茶皂素在溶液系統(tǒng)中的分配系數(shù)K在 0. 5~2,最后通過對(duì)高速逆流色譜儀的控制調(diào)節(jié)，使得分離的茶皂素純度可達(dá)95%以上。
[0007] 公開號(hào)為CN103772472A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種利用高速逆流色譜法從貝母 中分離純化貝母辛的方法，包括：1)取干燥貝母鱗莖，制備貝母總生物堿；2)采用高速逆流 色譜分離純化貝母辛；以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按體積比為2~4:5:2~3:5配成的混 合溶液作為固定相（上層）和流動(dòng)相（下層）；取貝母總生物堿粉末溶于等量的流動(dòng)相和 固定相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，觀察色譜圖，待目標(biāo)峰出現(xiàn)時(shí)收集餾分，揮干溶劑，得貝母辛。
[0008] 公開號(hào)為CN101602768的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種芝麻素和芝麻林素的提純方 法，先從芝麻油中分離得到不含脂肪類成分的木脂素類化合物，之后加入乙醚析出芝麻素； 過濾，所得濾液減壓濃縮后用氯仿溶解，然后加入石油醚至有白色渾濁出現(xiàn)，加熱溶解后靜 置析出芝麻林素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種高純度芝麻素和芝麻林素單體的制備方法。
[0010] 為達(dá)到上述目的，具體采用如下的技術(shù)方案：
[0011] -種高純度芝麻素單體和芝麻林素單體的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)采用有機(jī)溶劑對(duì)芝麻進(jìn)行回流提取，抽濾、將濾液濃縮成油狀，得總提取物；
[0013] (2)將總提取物用溶劑二次提取，取上清液蒸干，得芝麻粗提物；
[0014] (3)將A組分、B組分、C組分、D組分按體積比為1 :0? 2~1 :0? 5~3 :0? 2~1配 成精制溶劑體系，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，上層為固定相，下層為流動(dòng)相，所述A 組分為醚或烷烴，B組分為脂肪酯，C組分為脂肪醇，D組分為水；
[0015] (4)取芝麻粗提物溶于等量的流動(dòng)相和固定相（流動(dòng)相和固定相等量）中，得待分 離樣品；利用高速逆流色譜儀和所述的固定相和流動(dòng)相分離待分離樣品，根據(jù)檢測器紫外 光譜圖接收餾分，分別得到高純度的芝麻素單體和芝麻林素單體。
[0016] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，具體的，所述步驟（1)中有機(jī)溶劑為石油醚或/和正己 烷，芝麻與有機(jī)溶劑的料液比為1:5~l:20g/mL。步驟（1)中濃縮的方法可以采用真空旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式。
[0017] 具體的，所述步驟（2)中的溶劑為乙醇或/和甲醇，所述總提取物與溶劑的料液比 為1:1~l:5g/mL。步驟⑵中濃縮的方法可以采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（3)中將A組分、B組分、C組分、D組分按體積比為1 :0. 4~0. 7 : 0? 9~1. 1 :0? 5~0? 7配成精制溶劑體系。
[0019] 步驟（4)的具體過程為：用輸液栗快速將固定相注入高速逆流色譜儀的分離柱； 開啟高速逆流色譜儀，慢速注入溶劑系統(tǒng)的流動(dòng)相進(jìn)行平衡，溶劑系統(tǒng)達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平 衡即溶劑系統(tǒng)的上相（固定相）不流出時(shí)，注入由等量的流動(dòng)相和固定相溶解的芝麻粗提 物溶液；用紫外檢測器檢測流出液，根據(jù)所得的色譜圖收集目標(biāo)組分。
[0020] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，具體的，所述A組分為石油醚或正己烷，B組分為乙酸乙 酯或乙酸丙酯，C組分為甲醇或乙醇，D組分為水。
[0021] 優(yōu)選的，所述A組分為石油醚，B組分為乙酸乙酯，C組分為甲醇，D組分為水。
[0022] 作為本發(fā)明最佳的實(shí)施方式，所述精制溶劑體系為按體積比，石油醚：乙酸乙酯： 甲醇：水=1 :〇. 4 :1 :0. 5 ;或按體積比，正己燒：乙酸乙酯：甲醇：水=1 :0. 5 :1 :0. 5。
[0023] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟（4)中高速逆流色譜儀的轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，流動(dòng) 相的流速為〇? 5-3. OmL/min。
[0024] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述高速逆流色譜儀柱體積為230mL，上樣量為 220mg，轉(zhuǎn)速為800rpm，流動(dòng)相流速為2. OmL/min，固定相保留率為57%，檢測波長254nm。
[0025] 本發(fā)明的制備方法的優(yōu)點(diǎn)是：重現(xiàn)性和分離效果好、效率高、芝麻素和芝麻林素單 體產(chǎn)品的純度達(dá)到98%以上，芝麻素和芝麻林素單體的制備成本遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)，是一種 經(jīng)濟(jì)、高效的從芝麻中分離制備高純度芝麻素和芝麻林素單體的方法。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；
[0027] 圖2為實(shí)施例1的高速逆流色譜圖；
[0028] 圖3為實(shí)施例2的高速逆流色譜圖；
[0029] 圖4為實(shí)施例1芝麻粗提物的高效液相色譜圖；
[0030] 圖5為實(shí)施例1分離得到的芝麻素單體的高效液相色譜圖；
[0031] 圖6為實(shí)施例1分離得到的芝麻林素單體的高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 以下實(shí)施例中采用北京新技術(shù)所研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞 栗、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱（由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管 柱，容量為230mL)等組成。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 如圖1所示，本實(shí)施例中高純度芝麻素單體和芝麻林素單體的制備方法包括以下 步驟：
[0036] (1)取芝麻1. 1kg粉碎后用10L正己烷回流提取3次，每次2h，抽濾，濾液真空旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)成油狀，得到總提取物489. 5g ;
[0037] (2)將上述總提取物加500mL乙醇超聲提取3次，每次2h，取上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)，得芝麻粗提物10. 3g(如圖4所示）；
[0038] (3)按體積比，將石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水=1 :0. 4 :1 :0. 5配成精制溶劑體系， 置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開上層為固定相，下層 為流動(dòng)相；
[0039] (4)取220mg芝麻粗提物溶解于5mL上相（固定相）和5mL下相（流動(dòng)相）的混 合物中待用。利用高速逆流色譜儀，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用栗以灌滿色譜 分離柱，停栗。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)SOOrpm時(shí)，設(shè) 置流動(dòng)相流速為2. OmL/min，開始栗流動(dòng)相，達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡后，將溶解好的樣品用注 射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。 然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖（如圖所示2)接收收目標(biāo)成分，得芝麻素單體（如圖5所示） 和芝麻林素單體（如圖6所示）62. Omg和5. Omg，HPLC分析純度為99. 5%和98. 0%。
[0040] 利用高效液相色譜分析分離物，液相條件：Agilent C18色譜柱（4. 6X250mm， 5i〇,紫外檢測波長286nm，柱溫：25°C，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10yL，流動(dòng)相為甲醇：水 =80 ：20〇
[0041] 結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)分離得到的芝麻素和芝麻林素應(yīng)用進(jìn)行Agilent 5973N質(zhì)譜儀和 Varian 600MHz核磁共振波譜儀分別進(jìn)行MS，iH-NMR和13C-NMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下：
[0042] 芝麻素：白色粉末，ESI-MS(positive mode)，m/z 355. 1[M+H]+. iH-NMR^OOMHz, CD Cl3) S ppm: 3. 04 (2H, m, H-8，，H-8)，3. 86 (2H, dd, J = 9. 0, 4. 6Hz, H-9，a，H-9 a )，4. 22 (2H ，dd，J = 9. 0, 6. 6Hz H-9，0，H-9 0 )，4. 71 (2H，d，J = 3. 6Hz，H-7，，H-7)，5. 94 (4H，s，OCH 20)，6.77~6.84(3HX2，m，H-2，，H-5，，H-6，，H-2，H-5，H-6). 13C-NMR(600MHz，CDCl3)S: 135. 2 (2C，C-l，C-l '），106. 7 (2C，C-2, C-2 '），148. 1 (2C，C-3, C-3，），147. 3 (2C，C-4, C-4，）， 108.4(2C，C-5，C-5, )，119.5 (2C，C-6，C-6'），85.9 (2C，C-7，C-7，），54.5 (2C，C-8，C-8，）， 71. 9(2C, C-9, C-9r ), 101. 3(20CH20).
[0043] 芝麻林素：白色粉末，ESI-MS(positive mode),m/z 371. 2[M+H]+. iH-NMR^OOMHz, CDC13) S ppm: 3. 31 (H, m, H-8)，2. 95 (H, m, H-8 ' ），3. 64 (H, d, H-9)，3. 96 (H, d, H-9 ' ），4. 13 ( H，d，J = 4.2Hz，H-9)，4.45(H，t，J = 8.4Hz，H-9)，5.50(H，s，H-7)，4.40(H，d，J = 9.2Hz，H-V ), 5. 96 (2H, s, 0CH20), 5. 93 (2H, s, 0CH20), 6. 50 (H, d, J = 2. 4Hz, H-6), 6. 83 (H, s, H-6r ) ，6. 71 (H, s, H-5)，6. 79 (H, s, H-5 '），6. 62 (H, d, J = 2. 4Hz, H-2)，6. 88 (H, s, H-2 '）? 13C-NMR (600MHz，CDC13) S : 151. 8 (C-l)，100. 2 (C-2)，148. 1 (C-3)，142. 7 (C-4)，108. 2 (C-5)，108. 9 ( C-6), 106. 9 (C-7), 53. 3 (C-8), 71. 3 (C-9), 101. 2 (C-10), 134. 4 (C-lr ), 106. 6 (C-2r ), 147. 4(C-3r ),148.0(C-4, ),l〇8.2(C-5, ), 119. 7 (C-6^ , 87. 0 (C-7r ),52.8(C-8, ),69.8(C-9，hlOLUC-lO，）。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 芝麻素單體和芝麻林素單體制備流程圖如圖1所示。
[0046] 1.取芝麻1. 0kg粉碎后用石油醚回流提取3次，每次2h，過濾，濾液減壓濃縮成浸 膏，得到總提取物460. 8g。
[0047] 2.將上述總提取物加500mL甲醇超聲提取3次，每次2h，取上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 得芝麻粗提物9. 5g。
[0048] 3.分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1 :0. 5 :1 :0. 5,其余步驟同 實(shí)施例1。得到純度為99. 6 %和98. 3 %的芝麻素和芝麻林素單體70mg和6. 2mg，高速逆流 色譜分離紫外光譜圖見圖3。
[0049] 實(shí)施例3
[0050] 分離所選溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸丙酯：乙醇：水=1 :0. 5 :1 :0. 6,其余步驟同實(shí) 施例1。得到純度為99. 5 %和98. 2 %的芝麻素和芝麻林素單體71mg和6. 4mg。
[0051] 實(shí)施例4
[0052] 分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1 :0. 7 :1. 1 :0. 6,其余步驟同 實(shí)施例1。得到純度為99. 1 %和98. 1 %的芝麻素和芝麻林素單體58mg和5. 6mg。
[0053] 實(shí)施例5
[0054] 分離所選溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸丙酯：甲醇：水=1 :0. 6 :0. 9 :0. 5,其余步驟同 實(shí)施例1。得到純度為99. 4%和98. 4%的芝麻素和芝麻林素單體65mg和6. 4mg。
[0055] 實(shí)施例6
[0056] 分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1 :0. 5 :1. 1 :0. 7,其余步驟同 實(shí)施例1。得到純度為99. 0 %和98. 0 %的芝麻素和芝麻林素單體66mg和6. 7mg。
[0057] 實(shí)施例7
[0058] 分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷：乙酸丙酯：乙醇：水=1 :0. 4 :0. 9 :0. 5,其余步驟同 實(shí)施例1。得到純度為99. 2%和98. 4%的芝麻素和芝麻林素單體68mg和7. lmg。
[0059] 專利申請(qǐng)CN101602768介紹了一種芝麻素和芝麻林素的提純方法，采用了分步重 結(jié)晶的方法，獲得純度95%以上的芝麻素和芝麻林素，本申請(qǐng)純化階段采用高速逆流色譜 法，一次分離得到純度在98%含量以上的高純度芝麻素單體和芝麻林素單體，該方法具有 重現(xiàn)性好、分離量大、樣品無損失、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0060] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高純度芝麻素單體和芝麻林素單體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 采用有機(jī)溶劑對(duì)芝麻進(jìn)行回流提取，抽濾、將濾液濃縮成油狀，得總提取物； (2) 將總提取物用溶劑二次提取，取上清液蒸干，得芝麻粗提物； (3) 將A組分、B組分、C組分、D組分按體積比為1 :0. 2~1 :0. 5~3 :0. 2~1配成精 制溶劑體系，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，上層為固定相，下層為流動(dòng)相，所述A組分 為醚或烷烴，B組分為脂肪酯，C組分為脂肪醇，D組分為水； (4) 取芝麻粗提物溶于等量的流動(dòng)相和固定相中，得待分離樣品；利用高速逆流色譜 儀和所述的固定相和流動(dòng)相分離待分離樣品，用紫外檢測器檢測流出液，根據(jù)所得的色譜 圖收集目標(biāo)組分，分別得到高純度的芝麻素單體和芝麻林素單體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中有機(jī)溶劑為石油醚或 /和正己烷，芝麻與有機(jī)溶劑的料液比為1:5~1:20g/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中的溶劑為乙醇或/和 甲醇，所述總提取物與溶劑的料液比為1:1~l:5g/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述A組分為石油醚或正己 烷，B組分為乙酸乙酯或乙酸丙酯，C組分為甲醇或乙醇，D組分為水。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述A組分為石油醚，B組 分為乙酸乙酯，C組分為甲醇，D組分為水。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述精制溶劑體系為按體 積比，石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水=1 :〇. 4 :1 :0. 5。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述精制溶劑體系為按體 積比，正己燒：乙酸乙醋：甲醇：7義=1 :0. 5 :1 :0. 5。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中高速逆流色譜儀 的轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，流動(dòng)相的流速為0· 5-3. OmL/min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)采用有機(jī)溶劑對(duì)芝麻進(jìn)行回 流提取1~3次，每次1~3小時(shí)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)將總提取物用溶劑二次提 取1~3次，每次1~3小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C07D493/04GK105985351SQ201510079590
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日
【發(fā)明人】王岱杰, 周曉晶, 王尉, 王曉, 耿巖玲, 段文娟, 林楠
【申請(qǐng)人】山東省分析測試中心, 北京市理化分析測試中心