一種雞傳染性法氏囊病病毒vp2蛋白及其制備方法與應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制備方法與應(yīng)用，具體地，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No.1所示序列。制備該VP2蛋白方法包括以下步驟：1)化學(xué)合成SEQ ID No.1序列，2)構(gòu)建表達(dá)載體和3)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。該VP2蛋白可用于制備雞傳染性法氏囊病的疫苗。該SEQ ID No.1是根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子對雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得，比一般的從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2基因，更適應(yīng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，更能提高蛋白表達(dá)量。
【專利說明】
一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制備方法與應(yīng)用及 試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制 備方法與應(yīng)用及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒 (Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)侵害引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主 要侵害雛雞和青年雞的法氏囊。該病不僅造成雞只死亡還導(dǎo)致免疫抑制，是目前危害世界 養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。傳染性法氏囊病病毒屬于雙股雙節(jié)段dsRNA病毒，其基因組是由 A、B兩個雙鏈RNA片段組成。A片段長度為3200bp，B片段長度約為2800bP<3A片段具有兩個開 放閱讀框，大閱讀框0RF1編碼VP2、VP4、VP3三個蛋白質(zhì)，小開放閱讀框0RF2編碼VP5蛋白。B 片段只有一個0RF，編碼VP1蛋白。VP2蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的抗原性、免疫原 性、毒力、細(xì)胞嗜性等有關(guān)，另外，VP2蛋白也是IBDV的保護(hù)性抗原成分，與病毒中和性抗體 的誘導(dǎo)和識別等生物學(xué)功能有關(guān)，其位于病毒粒子的外表面，占總結(jié)構(gòu)蛋白量的51%，與另 一主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3-起構(gòu)成核衣殼的骨架。研究已經(jīng)證實VP2主要暴露在核衣殼的外面， 攜帶病毒主要的中和性抗原表位。
[0003] VP2基因在外源系統(tǒng)中表達(dá)的方法很多，比如原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(dá)量較高， 但產(chǎn)物往往為包涵體，不具備生物活性;酵母表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)產(chǎn)物的糖基化修飾不完全;而 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化等修飾，產(chǎn)生活性蛋白，但其表達(dá) 水平較低、不易于放大，而且細(xì)胞生長條件要求較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種雞傳染性法氏囊病毒VP2 蛋白。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0007] 作為優(yōu)選，該VP2蛋白由含有SEQ ID No. 1所示序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞表達(dá) 而得。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供制上述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，包 括以下步驟：
[0009] 1)合成:化學(xué)合成SEQ ID No. 1序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒；
[0010] 2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建包含SEQ ID No.l序列的表達(dá)載體；
[0011] 3)轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 組病毒。
[0012]作為優(yōu)選，步驟1)中，所述重組質(zhì)粒是通過將SEQ IDNo.l序列連接到PUC57載體 上，得到PUC57-VP2重組質(zhì)粒。
[0013]作為優(yōu)選，步驟2)中，利用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建包含SEQ IDNo.l序列的表達(dá)載體。 [0014] 作為優(yōu)選，步驟2)中，使用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物對重組質(zhì)粒 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0015] SEQ ID No·2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0016] SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟2)中，其PCR擴(kuò)增體系如下:rTaq酶2yL，重組質(zhì)粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL,SEQ ID No.3 0.5yL；
[0018] 其PCR擴(kuò)增程序如下:95°C預(yù)變性5min，l個循環(huán);95°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35個循環(huán);72°C延伸10min，1個循環(huán)。
[0019]作為優(yōu)選，采用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明的目的之三在于提供上述雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制備雞傳染性 法氏囊病的疫苗中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于檢測雞傳染性法氏囊病病毒的試劑盒，所述 試劑盒內(nèi)包括上述雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
[0022] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，編碼該蛋白的核苷酸序列含有 如SEQ ID No.l所示序列。該SEQ ID No.l是根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子對雞IBDV VP2基因進(jìn) 行密碼子優(yōu)化而得，比一般從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2基因，更適應(yīng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，更能提 尚蛋白表達(dá)量。
[0024]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0025] 圖1為pUC57-VP2擴(kuò)增產(chǎn)物;其中，Μ泳道為Mark，l泳道為目的基因 VP2;
[0026]圖2為重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2的雙酶切鑒定結(jié)果圖，其中Μ泳道為mark，l泳道為重 組質(zhì)粒pTriEx-4用SacI和Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果;2泳道為重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2用SacI 和Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果；
[0027] 圖3為SDS-PAGE檢測重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物，其中Μ泳道為mark， 1-3泳道為重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9的細(xì)胞產(chǎn)物;4泳道為為未感染病毒Sf 9的細(xì)胞產(chǎn) 物;5泳道為重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞裂解產(chǎn)物Ni-NTA純化結(jié)果；
[0028] 圖4為Western blot檢測重組桿狀病毒Bac_VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物；其中，Μ泳道為 mark; 1-2泳道:重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；3泳道： 未感染病毒Sf9細(xì)胞產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；
[0029] 圖5為IFA檢測重組桿狀病毒Bac_VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物。左圖：重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞的IFA分析結(jié)果;右圖：未感染病毒Sf9細(xì)胞的IFA分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，該VP2蛋白的核苷 酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0031] 本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病毒蛋白VP2的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0032] 1)優(yōu)化:根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子對雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到優(yōu)化 后的雞IBDV VP2基因序列；
[0033] 2)合成：化學(xué)合成優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì) 粒；
[0034] 3)構(gòu)建包含SEQ ID No. 1序列的表達(dá)載體；
[0035] 4)轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 組病毒。
[0036]本發(fā)明應(yīng)用VP2基因序列在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行過優(yōu)化，比一般從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2 基因，更適應(yīng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，更能提尚蛋白表達(dá)量；
[0037]本發(fā)明采用化學(xué)合成IBDV VP2基因的方法，與傳統(tǒng)組織提取DNA或RNA獲得目的基 因的方法相比，基因合成無需模板，因而不受基因來源限制，更經(jīng)濟(jì)、簡便、省時省力；
[0038]本發(fā)明以昆蟲細(xì)胞作為生物反應(yīng)器制備IBDV VP2,與細(xì)菌、酵母、真核細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)相比，因 sf9細(xì)胞生長條件簡單，可無⑶2、無血清、27°C生長，因此具有節(jié)省成本、產(chǎn)量高、 可大規(guī)模制備的優(yōu)點。
[0039] 本發(fā)明應(yīng)用的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)使用多角體啟動子，能夠高效表達(dá)蛋白，還有完善的 翻譯后修飾，而且昆蟲細(xì)胞可以無血清培養(yǎng)，能夠大規(guī)模用于蛋白的生產(chǎn)。
[0040] 以下【具體實施方式】中，如未特殊說明，所使用的試劑或儀器均可通過市售的途徑 獲得。
[0041 ] 實施例1:優(yōu)化雞IBDV VP2基因序列、合成并克隆
[0042] 參考GenBank上公布的雞IBDV VP2基因序列（登錄號AF508177)，根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏 愛密碼子對雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0043]化學(xué)合成優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列，并將其克隆到pUC57載體上，得到的載體 命名為 PUC57-VP2。
[0044] 實施例2:構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體pTriEx-4-VP2
[0045] 實施例2A)對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0046]設(shè)計了一對擴(kuò)增優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因全長的引物，并在上游引物5 '端加入保 護(hù)性堿基及SacI酶切位點，在下游引物5'端加入保護(hù)性堿基及Hindm酶切位點，引物序列 為：
[0047] SEQ ID No.2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0048] SEQ ID No.3:5 '-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3；
[0049] 下劃線部分分別是Sac I和Hind ΙΠ 酶切位點。
[0050] 其PCR反應(yīng)體系：rTaq酶8yL，pUC57-VP21yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL; ddH20 補(bǔ)足至 20yL;
[0051 ] 其中，rTaq酶購自TAKARA公司，pUC57-VP2的濃度為lOOng/yL，上游引物為SEQ ID No.2，濃度為20nM;下游引物為SEQIDNo.3，濃度為20nM。
[0052] 其PCR反應(yīng)程序為:95 °C預(yù)變性5min，1個循環(huán);95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延 伸90s，35個循環(huán);72°C延伸lOmin，1個循環(huán)。
[0053] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一個1400bp左右的片段，結(jié)果見圖 1，其中，Μ泳道為Mark，1泳道為目的基因 VP2。切膠回收后進(jìn)行純化。
[0054]實施例2B)將目的基因 VP2與載體質(zhì)粒pTriEx-4進(jìn)行連接
[0055] 將實施例2A)獲得的目的基因 VP2與載體質(zhì)粒pTriEx-4分別用SacI和Hindlll在37 °C恒溫箱中雙酶切2h后進(jìn)行連接。
[0056]其雙酶切操作的具體參數(shù)如下：
[0057] 雙酶切目的基因 VP2體系：目的基因 VP2 16yL、10XM buffer 2yL，SacI限制性內(nèi) 切酶lyL，Hindm限制性內(nèi)切酶lyL;
[0058] 雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4體系:載體質(zhì)粒pTriEx-4 lyg，10 XM buff er2yL，SacI 限制性內(nèi)切酶lyL，Hindm限制性內(nèi)切酶lyL，ddH20補(bǔ)足至20yL。
[0059] 上述雙酶切目的基因 VP2的產(chǎn)物、雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4的產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測，切膠后回收純化用T4連接酶在16°C進(jìn)行連接反應(yīng)，過夜，得到重組質(zhì)粒 pTriEx-4-VP2〇
[0060] 上述連接反應(yīng)體系：雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4的純化產(chǎn)物（30ngAiL) 2yL，雙酶切 目的基因 VP2的純化產(chǎn)物（50ngAiL)6yL，10XDNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL〇 [0061 ] 實施例2C)重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[0062] 將實施例2B)得到的重組質(zhì)粒pTriEx-4_VP2與大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞混勻后冰 浴30min，42°C水浴熱擊90s后立即轉(zhuǎn)移至冰上放置lOmin，加入LB新鮮培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u 床培養(yǎng)lh后，離心棄去部分上清，以剩余部分培養(yǎng)基重懸菌泥后均勾涂布于含Amp ici 11 in 的LB平板上，37 °C恒溫培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，于含Ampi ci 11 in (100ng/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，得到菌液。
[0063] 實施例2D)PCR鑒定陽性菌
[0064]取實施例2C)得到的菌液，進(jìn)行PCR鑒定，挑選出陽性菌。
[0065] PCR鑒定的反應(yīng)體系:rTaq酶8yL，菌液lyL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，ddH20 補(bǔ)足至20μL。上游引物為SEQIDNo.2，濃度為20nM ;下游引物為SEQIDNo.3，濃度為20nM。
[0066] PCR鑒定的反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min，l個循環(huán);95°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35個循環(huán);72°C延伸10min，1個循環(huán)。
[0067] PCR鑒定后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增得到1400bp左右基因片段即為 陽性菌，試劑盒提取陽性菌的質(zhì)粒。
[0068] 實施例2E)雙酶切鑒定
[0069]將實施例2D)得到的陽性菌的質(zhì)粒，經(jīng)SacI和Hindm雙酶切鑒定，其結(jié)果如圖2所 示，得到大小分別約是5.2kb和1.4kb的基因片段，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pTriEx-4-VP2,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。實施例3:轉(zhuǎn)染sf 9昆蟲細(xì)胞
[0070] 將無血清培養(yǎng)基(BacVector Insect Cell Medium)培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞鋪入六孔板， 鋪板濃度為1 X 106cells/孔。
[0071] 轉(zhuǎn)染體系:無血清培養(yǎng)基lmL;昆蟲轉(zhuǎn)染試劑5yL，桿狀病毒DNA 5yL;pTriEx-4-VP2 5yL;其中，昆蟲轉(zhuǎn)染試劑為品牌為GeneJuice?的轉(zhuǎn)染試劑；桿狀病毒的品牌及型號為 BacMagic?-3;pTriEx-4-VP2 重組質(zhì)粒的濃度為 500ng/yL。
[0072]棄去六孔板中的無血清培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染體系全部加入到板孔中，28°C繼續(xù)培養(yǎng)5d， 收集培養(yǎng)基，即為P1代重組桿狀病毒。
[0073] 將P1代重組病毒按照Μ0Ι = 0.05-0.1接種貼壁培養(yǎng)的Sf 9細(xì)胞傳代兩次，獲得P3代 重組桿狀病毒，命名為Bac-VP2,該病毒中含有得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的 重組病毒。
[0074] 實施例4:重組桿狀病毒Bac_VP2的鑒定
[0075]實施例4A)SDS-PAGE和Western blot聯(lián)合檢測
[0076] 將實施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接種懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，28°C繼續(xù)培養(yǎng) 72h后，離心收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解，獲得蛋白液。取少量上述蛋白加入5 X SDS LoadingBuffer，以10%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE結(jié)果如3所示，細(xì) 胞感染Bac-VP2后，其細(xì)胞裂解蛋白在58kDa附近有一條帶。
[0077]然后將上述SDS-PAGE電泳條帶轉(zhuǎn)印到NC膜上以5%脫脂奶粉封閉，先后以一抗稀 釋液(雞IBDV陽性血清)和二抗稀釋液(HRP標(biāo)記兔抗雞IgG)孵育，DAB底物顯色后觀察特異 性條帶以確定雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果如圖4所示，該條帶 與雞IBD陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
[0078]實施例4B)間接免疫熒光檢測
[0079] 將實施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接種貼壁培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，28°C繼續(xù)培養(yǎng) 72h后，棄掉培養(yǎng)基，以4 %多聚甲醛室溫固定30min; TOST洗滌三次并拍干后以1000倍稀釋 的雞IBD陽性血清為一抗4°C孵育過夜；以PBST洗滌三次并拍干后以2000倍稀釋的FITC標(biāo)記 的兔抗雞IgG孵育，37 °C反應(yīng)2h;再次以PBST洗滌三次，置于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖5 所示，可以看到重組桿狀病毒Bac-VP2感染后的細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的熒光，而對比例則無熒光 反應(yīng)。
[0080] 實施例5:雞傳染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白的純化
[0081] 使用 Amic()n?Pro Affinity Concerntration Kit Ni-NTA進(jìn)行雞傳染性法氏 囊病毒IBDV VP2蛋白的純化。其具體操作步驟為:取200yL Ni-NTA加入到平衡柱中，1000X g離心lmin;以2.5倍體積的Binding buffer清洗平衡住，1000 X g離心lmin;取5mL實施例 4A)的蛋白液加入到平衡柱中，室溫低速搖床孵育60min，1000 X g離心lmin ;將Amicon Ultra-〇.5微型管介導(dǎo)平衡柱下方，再在平衡柱中加入500yL Elution buffer，4000Xg離 心15min;再將Ami con Ultra-0.5微型管倒置放入2mL收集管，1000 X g離心2min，獲得純化 蛋白HiS-VP2，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。
[0082] 實施例6:間接ELISA方法
[0083] 將實施例5獲得的純化蛋白His-VP2用包被液稀釋至5mg/L，取lOOyL/孔包被酶標(biāo) 板，4 °C過夜；將陽性血清和陰性血清分別稀釋100倍，37 °C孵育2h; PBST洗滌三次后加入稀 釋的兔抗雞IgG孵育，37°C反應(yīng)lh;再以TOST洗滌三次，TMB顯色15min;加入2M H2S〇4終止反 應(yīng)，于450nm處讀取吸光值，結(jié)果如表1所示。
[0084] 表1間接ELISA鑒定結(jié)果
[0087] 臨界值=0 · 168+0 · 0890 X 3 = 0 · 435，P/N>2 · 1;
[0088] 即以此種用于檢測雞傳染性法氏囊病病毒的ELISA檢測試劑盒成立。
[0089] 在進(jìn)行ELISA檢測時，100倍稀釋的待檢血清0D45Q>0.435，即可視為陽性。
[0090]上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含 有如SEQ ID No.l所示序列。2. 如權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，該VP2蛋白由含有 SEQ ID No.l所示序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞表達(dá)而得。3. 制備如權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 合成:化學(xué)合成SEQ ID No.l序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒； 2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建包含SEQ ID No.l序列的表達(dá)載體； 3) 轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重組病 毒。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述重組質(zhì)粒是通過將SEQ IDNo. 1序列連接到pUC57載體上，得到pUC57-VP2重組質(zhì)粒。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，利用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建包含SEQ IDNo. 1序列的表達(dá)載體。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，使用如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增， SEQ ID No.2:5，-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3,； SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中，其PCR擴(kuò)增體系如下:rTaq酶2yL， 重組質(zhì)粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL，SEQ ID Νο·3 0.5yL; 其PCR擴(kuò)增程序如下:95 °C預(yù)變性5min，1個循環(huán);95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 90s，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin，1個循環(huán)。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，采用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體。9. 如權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制備雞傳染性法氏囊病的 疫苗中的應(yīng)用。10. -種用于檢測雞傳染性法氏囊病病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括如 權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
【文檔編號】A61K39/12GK106046123SQ201610375787
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】任廣彩, 劉傳高, 黃妙容, 陳瑞愛
【申請人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司